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Sep 06, 2023

モジュール式で調整可能なタンパク質バイオセンサーの新規設計

Natura Volume 591, pagina

Nature volume 591、pages 482–487 (2021)この記事を引用

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メトリクスの詳細

天然に存在するタンパク質スイッチは、細胞および臨床用途のためのバイオセンサーおよびレポーターの開発に再利用されています1。 ただし、そのようなスイッチの数は限られており、再設計するのは困難です。 今回我々は、ペプチドキーの結合が目的の生物学的出力を引き起こす、新たに設計されたタンパク質スイッチを介して情報の流れを逆転させることによって、一般的なタンパク質ベースのバイオセンサーを作成できることを示す2。 設計されたセンサーは、閉じた暗状態と開いた発光状態を備えたモジュール式分子デバイスです。 分析物の結合により、スイッチが閉状態から開状態に切り替わります。 このセンサーは分析物の結合とセンサーの活性化の熱力学的結合に基づいているため、必要な標的結合ドメインは 1 つだけであり、これによりセンサーの設計が簡素化され、溶液中での直接読み取りが可能になります。 抗アポトーシスタンパク質BCL-2、IgG1 Fcドメイン、HER2受容体、ボツリヌス神経毒素Bを高感度に検出できるバイオセンサー、心筋トロポニンIや抗B型肝炎ウイルス抗体のバイオセンサーを高感度に開発します。これらの分子を臨床的に検出するには必要です。 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2)3 を追跡するための診断ツールの必要性を考慮して、私たちはこのアプローチを使用して、SARS-CoV-2 スパイクタンパク質用のセンサーと、膜タンパク質およびヌクレオカプシドタンパク質に対する抗体を設計しました。 前者は新たに設計されたスパイク受容体結合ドメイン (RBD) バインダー 4 を組み込んでおり、検出限界は 15 pM で、発光シグナルはバックグラウンド レベルの 50 倍です。 プラットフォームのモジュール性と感度により、幅広い分析対象に対するセンサーの迅速な構築が可能になり、新しく有用な機能を備えた多状態タンパク質システムを作成するための新規タンパク質設計の力が強調されます。

タンパク質ベースのバイオセンサーは、合成生物学や臨床応用において重要な役割を果たしていますが、これまでのバイオセンサーの設計は、ほとんどが天然タンパク質の再設計に限定されてきました1。 結合時に構造変化を受ける特定の分析物結合ドメインを見つけることは困難であり、たとえ利用可能だったとしても、それらをレポータードメインに効果的に結合するには、一般に広範なタンパク質工学的努力が必要となります5、6。 したがって、目的の異なるタンパク質標的を検出するために容易に再利用できるモジュール式バイオセンサープラットフォームを構築することが望ましい。 抗体 7、8、9 および低分子 10、11 を検出するモジュール式システムが開発されていますが、タンパク質の構造、サイズ、オリゴマー化状態の多様性、および半合成タンパク質プラットフォームなどのアプローチを考慮すると、一般的なタンパク質センサーはより大きな課題となります 12、13、14 、またはカルモジュリンスイッチ15、16は、通常、予測可能性が限られているため、潜在的な候補を見つけるためにかなりのスクリーニングを必要とします17。

タンパク質バイオセンサーは、2 つのほぼ等エネルギー状態を持つシステムから構築でき、それらの間の平衡は感知される分析物によって調節されます。 このようなセンサーの望ましい特性は次のとおりです。(i) 分析物によって引き起こされる構造変化は、分析物の詳細から独立している必要があり、そのため、同じシステム全体を使用して多くの異なるターゲットを感知できます。 (ii) システムは、異なる結合エネルギーと異なる典型的な濃度を持つ検体を広いダイナミック レンジにわたって検出できるように調整可能である必要があります。 (iii) 構造変化は敏感な出力と結び付けられるべきである。 我々は、これらの属性は、ペプチドアクチュエーターの存在によって目的の標的タンパク質への結合が制御される新規に設計されたタンパク質スイッチの情報の流れを逆転させることによって達成できるのではないかと仮説を立てました2。 我々は、2 つのタンパク質成分からなるシステムを開発しました。1 つは、ケージ ドメインと、標的結合モチーフとスプリット ルシフェラーゼ フラグメント (small BiT (SmBiT) 114) を含むラッチ ドメインで構成される「lucCage」18。 2番目は、lucCageの開いた状態に結合する重要なペプチドと相補的な分割ルシフェラーゼフラグメント（ラージBiT（LgBit）11S）18を含む「lucKey」です（図1a）。 lucCage には 2 つの状態があります。1 つはケージドメインがラッチに結合し、結合モチーフが標的に結合するのを立体的に遮断し、SmBiT が LgBit と結合してルシフェラーゼ活性を再構成するのを妨げる閉状態と、これらの結合相互作用が再構成される開状態です。ブロックされていないため、lucKey はケージ ドメインにバインドできます。 lucKey と lucCage の結合により、ルシフェラーゼ活性が再構成されます (図 1a、右)。 システムの熱力学は、lucKey の lucCage への結合自由エネルギー (ΔGCK) が、ターゲットが存在しない場合 (ΔGopen − ΔGCK >> 0)、lucCage が開く自由エネルギーコスト (ΔGopen) を克服するには不十分であるように調整されています。標的の存在により、標的に対するラッチの追加の結合自由エネルギー（ΔGLT）がラッチの開きとルシフェラーゼの再構成を促進します（ΔGopen − ΔGCK − ΔGLT << 0）（図1b、c）。 このシステムは、広範囲の結合活性をケージに入れることができ、スイッチが熱力学的に制御されるため、lucKey およびターゲット結合エネルギーを調整して、関連するターゲット濃度での活性化を達成できるため、上記の特性 (i) および (ii) を満たします。 lucKey と lucCage は常に同じであるため、システムはモジュール式であり、同じ分子結合を多くの異なる標的の結合に結び付けることができます。 生物発光は、特性 (iii) を満たす、分析物による lucCage – lucKey 関連の迅速かつ高感度な読み取りを提供します。

a、センサーの概略メカニズム。 lucCage の閉鎖型 (左) は lucKey に結合できないため、分割されたルシフェラーゼ SmBiT フラグメントが LgBit と相互作用することが妨げられます。 開いた形 (右) はターゲットとキーの両方に結合でき、ルシフェラーゼ活性のために SmBiT と LgBiT を再構成できます。 b、バイオセンサー活性化の熱力学。 閉じたケージ (種 1) から開いたケージ (種 2) への移行の自由エネルギー コスト (ΔGopen) は、ターゲットの非存在下でのキー (種 5) の関連付けとルシフェラーゼ活性 (種 6) の再構成を妨げます。 ターゲットの存在下では、ターゲット結合 (2→3; ΔGLT)、キー結合 (3→4; ΔGCK)、および SmBiT-LgBiT 結合 (4→7; ΔGR) の結合自由エネルギーが、不利な ΔGopen を克服し、 lucCage の開口とルシフェラーゼ活性の再構成。 c、バイオセンサー設計の熱力学。 設計可能なパラメータは ΔGopen と ΔGCK です。 ΔGR はすべてのターゲットで同じであり、ΔGLT はターゲットごとに事前に指定されます。 高感度だがバックグラウンドが低い分析対象物を検出するには、ターゲットが存在しない場合、閉状態 (種 1) の自由エネルギーが開状態 (種 6) よりも大幅に低く、自由エネルギーが高くなるように、ΔGopen と ΔGCK を調整する必要があります。ターゲットの存在下で開いた状態 (種 7)。

このバイオセンサー システムの状態は熱力学的平衡状態にあり、調整可能なパラメーター ΔGopen および ΔGCK が、結合ドメインへの分析物の結合の自由エネルギー ΔGLT とともに、可能な種の集団を支配します (図 1b)。 センサーシステムのΔGopen（拡張データ図1a）、ΔGLT（拡張データ図1b）、分析対象物とセンサーコンポーネントの濃度（拡張データ図1c、d）への依存性をシミュレーションしました。 検体検出の感度は ΔGLT の関数であり、下限は検体結合の解離定数 (Kd) の約 10 分の 1 です (拡張データ図 1b)。 この下限を超えると、lucCage と lucKey の濃度を変化させることで、システムがさまざまな範囲のターゲット濃度に応答できるようになります (拡張データ図 1c、d)。 感度は、分子内ケージ-ラッチ相互作用および分子間ケージ-キー相互作用（それぞれΔGopenおよびΔGCK）の強度を調整することによってさらに調整できます。 たとえば、ケージとラッチの相互作用が強すぎると、ターゲットの存在下でシグナルが低くなり、相互作用が弱すぎると、ターゲットの非存在下でバックグラウンドシグナルが高くなります（拡張データ図1a、e）。 私たちの設計戦略は、ラッチ（およびキー）ヘリックスの長さを変化させ、ケージとラッチまたはケージとキーの界面に有利な疎水性または不利な埋没極性相互作用を導入することによって、ΔGopen とΔGCK を調節することによって、このバランスを見つけることを目的としています2（拡張データ図） .1f、g）。

これらの原理に基づいてセンサーを設計するために、得られるタンパク質が閉じた状態で安定し、ターゲットとの相互作用がブロックされるように、ラッチ内のターゲット結合ペプチドの配置を特定する「GraftSwitchMover」ロゼッタベースの方法を開発しました（補足方法） ）。 最初のテストとして、前述の最適化された非対称 LOCKR スイッチ 2 の閉状態で SmBiT ペプチドと BIM ペプチドをグラフトしました (拡張データ図 2)。 SmBiT はルシフェラーゼホロ酵素内で β ストランド構造をとりますが、二次構造は状況に依存する可能性があるため、らせんバンドル足場の状況でらせん二次構造を採用できると考えられました 19。 ラッチ全体にわたる 2 つのペプチド配列の異なる配置をサンプリングし、最もエネルギーの低いソリューション (拡張データ図 2a) を選択し、大腸菌で 12 のデザインを発現しました。 設計をlucKeyと1:1の比率で混合し、ナノモルの親和性でBIMに結合するBCL-2を加え20、発光の急速な増加を観察しました（拡張データ図2b、f;これらのうち最良のものを参照します）これは、逆に動作する LOCKR アクチュエータ 2 がバイオセンサーとして機能できることを示しています。 分析物の検出範囲は、モデルシミュレーションで予想されたように（拡張データ図1c）、センサー（lucCageとlucKey）の濃度を変えることによって調整できます（拡張データ図2g）。 lucCageBIM には、ラッチの 312 位に SmBiT があります (SmBiT312) (拡張データ図 2d)。 この配置のケージ (lucCage) は、以下に説明するバイオセンサーのベース足場として使用されました。

次に、ペプチドではなく標的結合タンパク質を閉じた状態でコンピューターによってケージングする方法を開発することにより、lucCage 内での対象分析物のさまざまな結合様式の組み込みを調査しました (補足方法)。 テストケースとして、新たに設計したインフルエンザA型H1赤血球凝集素（HA）21結合タンパク質HB1.9549.2を、安定性を向上させ、結晶化の取り組みを促進するように最適化されたLOCKRスイッチ22（sCage）の短縮バージョンにケージ化しました（図2a）。 5 つの設計のうち 2 つは機能し、キーの存在下では HA に結合しましたが、キーの不在下では結合しませんでした (拡張データ図 3b)。 2.0 Åの分解能で決定された最良の設計であるsCageHA_267-1Sの結晶構造（補足表1、タンパク質データバンク（PDB）コード7CBC）は、1つ（Phe273）を除くすべてのHA結合界面残基がケージドメインと相互作用することを示しました。 （ターゲットへのラッチの結合をブロック）設計で意図されているとおりです（図 2a、拡張データ図 3a ～ c​​）。

a、設計されたインフルエンザ結合タンパク質をLOCKRスイッチ内にケージするsCageHA_267-1Sの構造検証。 左、インフルエンザ赤血球凝集素のステム領域（HA、緑のリボン）に結合したde novoバインダーHB1.9549.2（シアンのリボン）の設計モデル21。 右、LOCKR スイッチ 22 (sCage、黄色のリボン) の短縮安定化バージョンにグラフトされた HB1.9549.2 (シアン) を含む、sCageHA_267_1S の結晶構造 (PDB コード 7CBC)。 中央、HA への結合に関与する HB1.9549.2 の残基 (マゼンタ、上) のうち、F273 を除くすべての残基がスイッチの閉状態 (下) に埋め込まれています。 マゼンタのラベルは、2 つのパネルの同じアミノ酸セットを示します (たとえば、上のパネルの F2 は下のパネルの F273 に対応します)。 b–d、lucCageBot (b)、lucCageProA (c)、および lucCageHER2 (d) の機能的特徴。 左の構造モデルは、BoNT/B 用に新たに設計されたバインダー (Bot.671.2)21 (b)、プロテイン A の C ドメイン (SpA C)23 (c) または HER2 結合アフィボディ 24 (d) を lucCage (青色) に組み込んでいます。リボン) とケージ化された SmBiT フラグメント (ゴールド リボン)。 中央は、10nMの各lucCageと10nMのlucKeyの混合物に50nMの分析物（BoNT/B（b）、IgG Fc（c）またはHER2（d））を添加した後の発光強度の測定。 右、バイオセンサー (lucCage と lucKey) の濃度を変更することによる幅広い分析対象物濃度の検出 (色付きの線)。 すべての実験は 3 回実行され、代表的なデータが示されています。データは平均値 ± SD です。

この設計コンセプトの構造検証により、我々は次に、ボツリヌス神経毒素 B (BoNT/B)、免疫グロブリン Fc ドメイン、および HER2 受容体用のセンサーの開発を目指しました。 我々は、新たに設計したボツリヌス神経毒素用バインダー (Bot.0671.2)21、汎用抗体結合タンパク質 A23 の C ドメイン、および HER2 結合アフィボディ 24 を lucCage に移植しました。 各ターゲットについていくつかのデザインをスクリーニングした後 (拡張データ図 4、5)、BoNT/B (図 2b、拡張データ図 4)、ヒト IgG を検出できる高感度の lucCage (lucCageBot、lucCageProA、および lucCageHER2) を取得しました。 Fc ドメイン (図 2c、拡張データ 図 5a ～ d)、および HER2 受容体 (図 2d、拡張データ 図 5e ～ h) はそれぞれ、プラットフォームのモジュール性を示しています。 設計されたセンサーはターゲットの追加後数分以内に応答し、lucCage と lucKey の濃度を変更することで感度を調整できます (図 2)。 さらなる開発により、これらのセンサーは、食品産業におけるボツリヌス神経毒素の迅速かつ低コストの検出25、および転移性乳房に関連する可溶性HER2の血清学的レベル（>15 ng ml-1; lucCageHER2の検出範囲内）の検出を可能にする可能性がある。がん26．

次に、急性心筋梗塞の標準的な早期診断バイオマーカーである心筋トロポニン I のセンサーを設計しました 27。 心筋トロポニンT、C、I（それぞれcTnT、cTnC、cTnI）間の高親和性相互作用を利用し（図3a）、6つの切断されたcTnT配列を異なるラッチ位置に挿入することにより11のバイオセンサー候補を設計しました（拡張データ図） .6a)。 最良の候補であるlucCageTrop627はcTnIを検出できたが、急性心筋梗塞患者の診断におけるcTnIアッセイのルールインおよびルールアウトレベルが低ピコモル範囲にあるため、臨床使用に十分な低レベルではなかった27。 当社のセンサープラットフォームの検出限界（LOD）はラッチターゲット親和性（KLT）の約 0.1 × Kd であるため、cTnI 結合親和性を高めることで lucCageTrop627 の感度を向上させることを目指しました。 3つの心筋トロポニン間の高親和性相互作用を利用するために、センサーのC末端にcTnCを融合しました（拡張データ図6b-d）。 得られたセンサー lucCageTrop は、臨床サンプルの定量化に適した 1 桁のピコモル LOD を持っています (図 3b、拡張データ、図 6e、f)。

a、cTnIセンサーの設計。 左、心筋トロポニンの構造 (PDB コード 4Y99)。 cTnT、cTnC、cTnI はそれぞれシアン、緑、マゼンタで示されています。 そう、lucCageTropのデザインモデル。 b、左、発光シグナルは、1 nM cTnIを0.1 nM lucCageTropとlucKeyに添加した後に増加します。 右、センサーコンポーネント (色付きの線) の濃度を変更することで、広い検出範囲にアクセスできます。 灰色の領域は、急性心筋梗塞の診断に関連する cTnI 濃度範囲を示します 27。 点線は、世界保健機関 (WHO) によって定義された急性心筋梗塞の臨床カットオフ (0.6 ng ml-1、25 pM) を示します。 c、HBVセンサー設計モデル（金、SmBiT、灰色、リンカー、マゼンタ、HBV preS1エピトープ）。 d、2つのエピトープコピーを持つlucCageHBVαは、抗HBV抗体HzKR127-3.2（Kd = 0.68 nM）に対する生体層干渉法による親和性が、lucCageHBV（Kd = 20 nM）よりも高い。 e、左、発光シグナルは、1 nM lucCageHBVα プラス lucKey に 50 nM 抗 HBV 抗体を添加した後に増加します。 そうです、幅広い濃度範囲にわたって高感度の抗 HBV 抗体を検出します。 f、lucCageHBVを使用したpreS1の検出メカニズム。 g、抗HBV抗体(「1」)、続いてpreS1(「2」)を添加した後の生物発光の動態。これは、抗体のセンサーと競合することによって生物発光を減少させる。 h. preS1 の検出は、抗体の濃度を変えることによって (色付きのラベルで示される)、関連する HBV 感染後の濃度レベル (灰色の領域) にわたって達成できます。 すべての実験は 3 回実行され、代表的なデータが示されています。データは平均値 ± SD です。

特定の抗体の検出は、集団内での病原体の蔓延 28、ワクチン接種の成功 29、および治療用抗体のレベル 9 をモニタリングするために重要です。 私たちのシステムを血清学的抗体分析に適応させるために、目的の抗体によって認識される線状エピトープを lucCage に組み込むことにしました。 私たちは最初に、B 型肝炎ウイルス (HBV) 表面タンパク質 L30 の preS1 ドメインに対する抗体のセンサーを開発しました。 「lucCageHBV」と呼ばれる、テストされた8つのデザインのうち最良のものは、抗HBV抗体HzKR127-3.231の添加後にルシフェラーゼ活性が約150％増加しました（拡張データ図7a〜d）。 lucCageHBVのダイナミックレンジとLODをさらに改善するために（拡張データ図7e）、ラッチの末端にペプチドの2番目のコピーを導入して、二価抗体（KLT）とのラッチ親和性を高めました（図3c、d） 。 結果として得られたデザインは「lucCageHBVα」と呼ばれ、LOD 260 pM、ダイナミックレンジ 225% を持ち（図 3e、拡張データ図 7g–i）、発光強度はカメラで簡単に検出できました（拡張データ図 7g–i）。 7j）。 血清中のほとんどの治療用抗体の濃度は低マイクロモルからナノモルの範囲にあるため9、このプラットフォームは循環中の治療用抗体の濃度をモニタリングするのに役立つはずです32。

次に、lucCageHBV センサーを使用して HBV 表面抗原を検出することを試みました。 私たちのセンサーは熱力学的制御下にあるため、事前に組み立てられたセンサーと抗体の複合体は標的HBV表面抗原タンパク質preS1の存在下で再平衡化し、抗体はlucCageHBV上のエピトープではなく遊離のpreS1に結合するように再分布するのではないかという仮説を立てました（図） .3f）。 lucCageHBVとHzKR127-3.2の混合物の発光は、preS1ドメインの添加直後に減少しました（図3g）。 この読み取り値の感度により、臨床的に関連する範囲での preS1 濃度の定量化が可能になりました 33 (図 3h、拡張データ図 7f)。

新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミックにより、SARS-CoV-2 ウイルスと抗ウイルス抗体の両方の診断ツールが緊急に必要とされています3。 抗 SARS-CoV-2 抗体のセンサーを設計するために、我々はまず、コロナウイルス科の「一般的な」株には存在しない、SARS-CoV34、35 および SARS-CoV-236 のプロテオーム内の免疫原性の高い線状エピトープを文献から特定しました。 これらの中で、我々は、SARS および COVID-1935 患者の血清によって認識され、交差反応性の動物由来の抗体が市販されている膜 (M) タンパク質とヌクレオカプシド (N) タンパク質の 2 つのエピトープに焦点を当てました。 ）。 各エピトープのセンサーを設計し、抗膜抗体および抗ヌクレオカプシド抗体に特異的に応答する設計を特定しました（拡張データ図8a、b）。 これらのセンサーは 2 ～ 5 分で最大信号に達し、低ナノモル量の抗体に応答して約 50 ～ 70% のダイナミック レンジを備えました (図 4a、b、拡張データ図 8c、d)。

a、左、lucCageSARS2-M センサーには、柔軟なスペーサーで接続された SARS-CoV-2 膜タンパク質 1 ～ 17 エピトープ (赤色) の 2 コピーが組み込まれています。 中央は、SARS-CoV-1 の残基 1 ～ 17 と交差反応する 100 nM 抗 SARS-CoV-1-M ウサギ ポリクローナル抗体 (pAb) を添加した後の 50 nM lucCageSARS2-M と lucKey の発光活性化の動態。 2 膜タンパク質。 右、さまざまな濃度の標的抗 M ポリクローナル抗体に対する 5 nM lucCageSARS2-M と lucKey の応答。 b、左、lucCageSARS2-N には、SARS-CoV-2 ヌクレオカプシドタンパク質 369 ～ 382 エピトープ (水色) のコピーが 2 つ組み込まれています。 中央は、エピトープを認識する 100 nM 抗 SARS-CoV-1-N マウス モノクローナル抗体 (クローン 18F629.1) の添加後の 50 nM lucCageSARS2-N と lucKey の発光活性化の動態。 右、さまざまな濃度の抗 N モノクローナル抗体に対する 50 nM lucCageSARS2-N と lucKey の応答。 c、左、lucCageRBD には新規 SARS-CoV-2 RBD バインダー 4 (LCB1、マゼンタ) が組み込まれています。 中央の発光強度は、16.7 nM SARS-CoV-2 RBD または三量体スパイクタンパク質を 1 nM lucCageRBD と lucKey の混合物に添加した後に増加します。 右、緩衝液、10% 合成鼻マトリックス 38 または 10% 血清中の分析対象物濃度の範囲にわたる検出。 d、バイオセンサーの特異性。 1 nM の各センサーを、50 nM の同族標的 (マゼンタ線) および他のバイオセンサーの標的 (灰色の線) とインキュベートしました。 ターゲットは、BCL-2、BoNT/B、ヒト IgG Fc、HER2、cTnI、抗 HBV 抗体 (HzKR127-3.2)、抗 SARS-CoV-1-M ポリクローナル抗体、および SARS-CoV-2 RBD です。 すべての実験は 3 回実行され、代表的なデータが示されています。データは平均値 ± SD です。

SARS-CoV-2 ウイルス粒子を直接検出できるセンサーを作成するために、LCB14 という名前の SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン (RBD) に新たに設計したピコモル アフィニティー バインダーを lucCage フォーマットに統合しました (図.4c）。 テストした13の候補のうち、「lucCageRBD」と呼ぶ最良の候補は、単量体RBDと完全三量体SARS-CoV2スパイクタンパク質37の両方を、それぞれ15 pMと47 pMのLODで検出でき、検出器のダイナミックレンジは1,700%を超えた。 RBD 検出 (図 4c、拡張データ、図 9)。 lucKey を短縮することでケージキーアフィニティ (KCK) を調整することで、lucCageRBD のダイナミックレンジを 5,300% までさらに増加し​​ました (拡張データ図 10a–c)。 ウイルスの検出に加えて、RBD センサーは、HBV 抗体の検出について上記で説明したものと同様の競合形式を使用して、ワクチン接種に応答した抗体生成を監視するためにも使用できます (図 3f)。これは、広範囲にわたって応答を定量化する能力です。ダイナミックレンジの向上と、RBD 上の ACE2 結合部位に結合する中和抗体 (したがってセンサー内の LCB1 と競合) を、他の場所に結合する非中和抗体から区別できることは、ラテラル フロー アッセイを上回る潜在的な利点です。

複雑な生物学的マトリックスで機能するセンサープラットフォームの能力を評価するために、緩衝液中のlucCageRBD、シミュレートされた鼻マトリックス38、およびヒト血清によるRBD検出を比較し、後者の2つの条件ではわずかな減少のみが観察されました（図4c）。 M. Merkx39 による提案に従い、内部校正に BRET 基準 40 を使用して、4 人の異なるドナーからのスパイク血清サンプルとスパイク模擬鼻マトリックスにおける絶対発光シグナルの変動を制御し、そのような校正により RBD を正確に定量化できることを発見しました。センサーのダイナミックレンジが損なわれます (拡張データ図 11)。 これらの結果は、lucCage システムがポイントオブケア診断装置に使用できることを示唆しています。

設計したバイオセンサーの特異性をテストするために、各ターゲットに応答する各 lucCage の活性化動態を一度に 1 つずつ測定しました。 各センサーは、その同族ターゲットには迅速かつ敏感に反応しましたが、他のセンサーには反応しませんでした（図4d）。 ほとんどの場合、実際のセンサー (補足表 2、3) は、単純な熱力学モデルの予測どおりに機能しました。 たとえば、さまざまなキー濃度とセンサー濃度での実験では、パラメーター間の相関がほとんどないことがわかります。 ただし、飽和ターゲット濃度または高lucKey濃度での活性化レベルには、異なるセンサー間にかなりのばらつきがあり、ほとんどの場合、モデルによって予測される完全なルシフェラーゼ再構成で予想されるレベルよりも低くなります（拡張データ図10d–g、補足）表4)。 これは、ターゲット結合モチーフとルシフェラーゼ SmBiT がラッチ内で互いに隣接しているため、ラッチへのターゲット結合とルシフェラーゼ再構成の間の立体干渉の結果である可能性があります。 このような干渉は、スイッチ内の 2 つの間の距離を広げることで解決できます。 lucCage システムの可能性は、lucCageRBD センサーの高いダイナミック レンジ (5,300%) とピコモル感度によって実証されています。最適に近い Kopen 値により、低ターゲットでの活性化の程度を損なうことなく、ターゲットの非存在下で非常に低いバックグラウンドが得られます。濃度。

私たちのセンサーを、長年にわたって開発され大きな成功を収めてきた多くのタンパク質ベースのバイオセンサープラットフォームの文脈に置くことは有益です（補足説明、補足表5）。 私たちのセンサー プラットフォームは、システムの定義された閉状態と開状態の間の熱力学的結合に基づいているため、その感度は、センシング ドメインがターゲットに結合した後に発生する自由エネルギーの変化に依存しますが、結合相互作用の特定の形状には依存しません (半合成小分子センサー 10、11 にもこの特性があります)。 これにより、小さなペプチド、球状ミニタンパク質、抗体エピトープ、新たに設計されたバインダーなどのさまざまな結合様式を組み込むことが可能になり、最適化をほとんどまたはまったく行わずに、広範囲のタンパク質標的に対する高感度センサーを生成できます。 ポイント・オブ・ケア用途の場合、当社のシステムは、他の生物発光ベースのタンパク質バイオセンサー プラットフォーム 8 と同様、均質で洗浄不要、ほぼ瞬時に読み取れるという利点があります。 発光の定量化は、携帯電話のカメラなど、安価でアクセスしやすいデバイスを使用して実行できます8。 病院の設定では、多様なターゲットに対して同一の読み出しを行うセンサーをモジュール式に設計できるため、数百もの異なるセンサーのアレイを使用して、多数の異なる化合物の迅速な読み出しが可能になります。

最近まで、de novo タンパク質設計の焦点は、単一の深い自由エネルギーの最小値に対応する新しい構造を持つタンパク質の設計でした。 私たちの結果は、より複雑なマルチステート システムを容易に生成できるようになったこの分野の進歩を浮き彫りにしています。 他の新たに設計されたタンパク質と同様に、当社のセンサーは細胞内で高レベルで発現され、非常に安定しているため 41、その製造と流通が大幅に容易になるはずです。 lucCageRBD センサーの優れた性能によって強調されているように、当社のプラットフォームの一般的な「分子デバイス」アーキテクチャと、新たに設計された高親和性ミニタンパク質バインダー 4,21 の間には強力な相乗効果があります (これらの新たなミニタンパク質も効果的です)他のプラットフォームとの併用42)。 コンピューテーショナル デザインの能力が向上し続けるにつれて、lucCage センサーを使用して、より広範囲のターゲットをより高い感度で検出できるようになるはずです。 私たちの結果は、バイオセンサーを超えて、全く異なる課題を解決するために進化したネイティブタンパク質を再利用することで達成できるものよりも、現代の課題に対するより一般的な解決策を生み出すデノボタンパク質設計の可能性を強調しています。

低親和性 SmBiT 114 (VTGYRLFEEIL)18 は、RosettaScripts ベースのタンパク質設計アルゴリズムである GraftSwitchMover を使用して、前述 2 の非対称 LOCKR スイッチのラッチにグラフトされました (詳細については補足方法を参照)。 グラフトサンプリング範囲は残基 300 と 330 の間に割り当てられました。結果として得られた設計は、エネルギーが最小限に抑えられ、視覚的に検査され、その後の遺伝子合成、タンパク質生産、生化学分析のために選択されました。 拡張データ図 2 に記載されているように、ラッチ上の最適な SmBit 位置は、残基 312 での挿入であることが実験的に決定されました。この設計は、lucCage と名付けられました。 lucKey は、NanoLuc18 の LgBit を前述のキーペプチドに遺伝的に融合させることによって構築されました 2。 すべてのタンパク質配列を補足表 6 に示します。

ペプチドおよびエピトープについては、各センシング ドメインのアミノ酸配列を、Rosettascripts43 GraftSwitchMover を使用して、lucCage の残基 325 と 359 の間のすべてのα-ヘリックス レジスターに移植しました。 挿入する目的の配列が lucCage ラッチの長さを超える場合は、Rosetta Remodel44 を使用して lucCage の C 末端伸長をモデル化しました (詳細については補足方法を参照)。 得られた lucCages は、Rosetta fast Relax45 を使用してエネルギー最小化され、視覚的に検査され、通常 10 未満のデザインがその後のタンパク質生産と生化学的特性評価のために選択されました。

タンパク質ドメインについては、結合タンパク質ドメインと標的との界面を形成する主要な二次構造要素セグメントが同定された。 アミノ酸配列を抽出し、上記のように GraftSwitchMover または Rosetta Remodel を使用して lucCage に移植しました。 次に、MergePDBMover と Pymol 2.0 を使用して、スイッチのコンテキストで全長結合ドメインを位置合わせ、モデル化、視覚化しました (詳細については、補足方法を参照)。 設計は、Rosetta 高速リラックスを使用してエネルギーを最小限に抑え、選択のために視覚的に検査されました。

設計されたタンパク質配列は大腸菌発現用にコドン最適化され、pET21b+ または pET29b+ 大腸菌発現ベクター内の合成遺伝子として配列されました。 合成遺伝子は、N末端ヘキサヒスチジンタグとそれに続くTEVプロテアーゼ切断部位を含む各ベクターのNdeIおよびXhoI部位に挿入され、終止コドンがC末端に追加されました。

大腸菌 Lemo21(DE3) 株 (NEB) を、合成された目的の遺伝子をコードする pET21b+ または pET29b+ プラスミドで形質転換しました。 細胞は、カルベニシリンまたはカナマイシンを補充したLB培地中で24時間増殖させた。 細胞をカルベニシリンまたはカナマイシンを添加したStudier TBM-5052自己誘導培地に1:50 mlの比率で接種し、37℃で2〜4時間増殖させ、その後18℃でさらに18時間増殖させた。 細胞を4,000g、4℃で15分間遠心分離することによって収集し、30 mlの溶解緩衝液（20 mM Tris-HCl pH 8.0、300 mM NaCl、30 mM イミダゾール、1 mM PMSF、0.02 mg ml-1 DNase）に再懸濁しました。 。 細胞再懸濁液を 2.5 分間 (5 秒サイクル) の超音波処理によって溶解しました。 溶解物を、24,000g、4℃で20分間の遠心分離によって清澄化し、洗浄緩衝液（20 mM Tris-HCl pH 8.0、300 mM NaCl、 30 mM イミダゾール）。 樹脂を１０カラム容量（ＣＶ）の洗浄緩衝液で２回洗浄し、次いで３ＣＶの溶出緩衝液（２０ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール）で溶出した。 溶出したタンパク質をUltra-15遠心フィルターユニット（Amicon）を使用して濃縮し、TBS（25 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl）中でSuperdex 75 Increase 10/300 GL（GE Healthcare）サイズ排除カラムを使用してさらに精製しました。 。 単量体タンパク質を含む画分をプールし、濃縮し、液体窒素中で急速冷凍し、-80 °C で保存しました。

Synergy Neo2 Microplate Reader (BioTek) をすべての in vitro 生物発光測定に使用しました。 アッセイは、cTnI センサーについては、カルシウムを含む 50% DPBS (Gibco) と 50% Nano-Glo (Promega) アッセイ緩​​衝液で行い、その他のセンサーには 50% HBS-EP (GE Healthcare Life Sciences) と 50% Nano-Glo アッセイ緩​​衝液を使用しました。センサー。 まず、所望の濃度の10×lucCage、10×lucKeyおよび10×標的タンパク質をストック溶液から調製した。 白色不透明の96ウェルプレートの各ウェルについて、10μlの10×lucCage、10μlの10×lucKeyおよび20μlの緩衝液を混合して、示された濃度および比率に達した。 lucCage および lucKey コンポーネントを室温で 60 分間インキュベートして、事前平衡化を可能にしました。 プレートを1,000gで1分間遠心分離し、室温でさらに10分間インキュベートした。 次いで、５０倍に希釈したフリマジン（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μｌを各ウェルに添加した。 血清または模擬鼻マトリックス (110 mM NaCl、1% (w/v) ムチン、10 μg ml-1 ヒトゲノム DNA38) を含むアッセイでは、緩衝液組成を生物学的マトリックスで置き換えました。 標的の非存在下での生物発光測定は、注射後 1 分ごとに行われました (0.1 秒の積分と間隔中の 10 秒の振盪)。 約15分後、連続希釈した10×標的タンパク質10μlとブランクを注入し、生物発光速度論的取得を合計2時間継続した。 生物発光対分析物のプロットから最大半値有効濃度 (EC50) 値を導き出すために、個々の分析物濃度における上位 3 つのピーク生物発光強度を平均し、ブランクから差し引き、シグモイド 4PL 曲線に適合させるために使用しました。 LOD を計算するために、分析物に対するセンサーの生物発光応答の線形領域が抽出され、線形回帰曲線が得られました。 これを使用して、応答の標準偏差と検量線 (S) の傾きを導き出しました。 LOD は 3 × (sd/S) として決定されました。

血清検体は、ワシントン大学病院の臨床化学部門の責任者から提供された、男女の成人 (>18 歳) からの過剰な血漿または血清に由来しました。 匿名化されたドナー検体はすべて、匿名化された状態で提供されました。 ドナーは余剰の標本を他の実験研究に使用することに同意したため、追加の同意なしにそれらを私たちの研究に移すことができました。 すべてのサンプルは使用前に 0.22 μm フィルターを通過させました。 10×連続希釈モノマーRBD (167〜0.69 nM) 10マイクロリットル、20× lucCage (20 nM) 5 μl、20× lucKey (20 nM) 5 μl、20× Antares2 (2 nM) 5 μl、および10、20、25、または50μlのヒトドナー血清または模擬鼻マトリックスを1:1 HBS:Nano-Gloアッセイ緩​​衝液と混合して、総量75μlにしました。 プレートを1,000gで1分間遠心分離した。 次いで、緩衝液中で２５倍に希釈したフリマジン２５μｌを各ウェルに添加した。 生物発光シグナルは、470/40 nm および 590/35 nm チャネルの両方から 1 分ごとに合計 1 時間記録されました。 各時点での比率は、拡張データ図 11b に記載されている式によって計算されました。 単量体 SARS-CoV-2 RBD は、以前に記載されているように発現および精製されました 46。

タンパク質間の相互作用は、ストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサー (ForteBio) を使用する Octet RED96 システム (ForteBio) を使用して測定しました。 各ウェルには200μlの溶液が含まれており、アッセイバッファーはHBS-EP+バッファー（GE Healthcare Life Sciences、10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%（v/v）界面活性剤P20）に0.5%を加えたものでした。無脂肪粉乳ブロッティンググレードブロッカー (BioRad)。 バイオセンサーチップに分析対象ペプチドまたはタンパク質を 20 μg ml-1 で 300 秒間ロードし (0.5 nm 応答の閾値)、HBS-EP+ バッファー中で 60 秒間インキュベートしてベースライン測定を取得し、ケージを含む溶液に浸漬し、/または キーを 600 秒間押し続け (結合ステップ)、HBS-EP+ バッファーに 600 秒間浸漬します (解離ステップ)。 結合データは、ForteBio Data Analysis Software バージョン 9.0.0.10 を使用して分析されました。

BIM ペプチド配列 (EIWIAQELRRIGDEFNAYYA) は、「lucCage へのセンシング ドメインのコンピューターによるグラフティング」で説明されているように、lucCage 足場に組み込まれました。 選択されたデザインは大腸菌で発現され、精製され、発光活性化について特徴付けられました。 生物発光検出シグナルは、200nMの標的BCL-2タンパク質の存在下または非存在下で、20nMのlucKeyと混合した20nMのlucCageの各設計について測定した。 組換え BCL-2 は前述のように生成されました 47。

Bot.0671.2 de novo バインダー、黄色ブドウ球菌プロテイン A ドメイン C (SpaC)、HER2 抗体、および de novo RBD バインダー LCB1 の主な結合モチーフは、「lucCage へのセンシング ドメインの計算によるグラフティング」(配列については補足表 3 および 6 を参照してください)。 選択されたデザインは大腸菌で発現され、精製され、発光活性化について特徴付けられました。 設計は、200 nMの標的タンパク質の存在下または非存在下で、20 nMのlucKeyと混合した20 nMのlucCageの各設計の生物発光シグナルを測定することによってスクリーニングした。 使用した標的タンパク質は、前述のように発現したボツリヌス神経毒素 B HcB 48、ヒト IgG1 Fc-HisTag (AcroBiosystems、IG1-H5225)、およびヒト HER2-HisTag (AcroBiosystems、HE2-H5225) でした。 単量体 SARS-CoV-2 RBD および三量体 SARS-CoV-2 スパイク タンパク質 (Hexapro 安定化バージョン 37) は、前述のように発現および精製されました 46。

cTnT結合モチーフ配列を異なる長さの断片に切り詰め(拡張データ図6)、「lucCageへのセンシングドメインの計算によるグラフティング」に記載されているようにlucCage足場に通しました。 選択されたデザインは大腸菌で発現され、精製され、発光活性化について特徴付けられました。 １００ｎＭ ｃＴｎＩ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｚ０３３２０－５０）の存在下または非存在下で、２０ｎＭのｌｕｃＫｅｙと混合した２０ｎＭのｌｕｃＣａｇｅの各設計の生物発光シグナルを測定することによって、設計をスクリーニングした。 続いて、cTnC への融合による改良版である lucCageTrop は、lucCageTrop627 の C 末端に以下の配列を遺伝的に融合させることによって作成されました。

preS1 ドメインの結合モチーフ (GANSNNPDWDFN) を、Rosetta GraftSwitchMover を使用して、残基 336 以降のすべての位置で lucCage 足場にねじ込みました。 Rosetta FastRelax プロトコルに従って、タンパク質生産用に 8 つのデザインが選択されました。 lucCageHBVを選択するために、抗HVB抗体HzKR127-3.2(100nM)の存在下または非存在下で各設計lucCage(20nM)およびlucKey(20nM)の生物発光シグナルを測定することによって設計をスクリーニングした。 続いて、第２の抗原モチーフ（ＧＧＳＧＧＧＳＳＧＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＮ）を含む配列をｌｕｃＣａｇｅＨＢＶに遺伝的に融合させることによって、ｌｕｃＣａｇｅＨＢＶαを構築した。

SARS-CoV-2 膜タンパク質 (アミノ酸 1 ～ 31、1 ～ 17、および 8 ～ 24) およびヌクレオカプシドタンパク質 (アミノ酸 368 ～ 388 および 369 ～ 382) の抗原エピトープは、「 lucCage へのセンシング ドメインの計算によるグラフティング。 選択されたデザインは大腸菌で発現され、精製され、発光活性化について特徴付けられました。 50 nM のすべてのデザインを 50 nM lucKey と混合し、100 nM のウサギ抗 SARS-CoV 膜ポリクローナル抗体 (ProSci、3527) またはマウス抗 SARS-CoV ヌクレオカプシド モノクローナル抗体の存在下での発光の増加について実験的にスクリーニングしました。 (クローン 18F629.1、NovusBio NBP2-24745) 100 nM。

HB1.9549.2は、足場のラッチヘリックスに沿った異なる位置でsCage設計のための親の6ヘリックスバンドルに埋め込まれました。 より有利な分子内相互作用を促進するために、ラッチ上の 3 つの連続する残基が意図的にグリシンに置換され、立体構造の自由が可能になりました。 5 つのデザインは大腸菌で生成されました。 生物層干渉法分析は、Octet 機器 (ForteBio) を使用して、キー (2 μM) の存在下または非存在下で、精製ケージ (1 μM) とストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサー チップ (ForteBio) にロードされたビオチン化インフルエンザ A H1 HA21 を使用して実行されました。

合成 VH および VL DNA 断片を、ヒト Cγ1 および Cγ DNA 配列を含む pdCMV-dhfrC-cA10A3 プラスミドにサブクローニングしました。 リポフェクタミン (Invitrogen) を使用してベクターを HEK 293F 細胞に導入し、細胞を FreeStyle 293 (GIBCO)、5% CO2、37 °C 加湿インキュベーター内で増殖させました。 培養上清をプロテイン A-セファロースカラム (Millipore) にロードし、0.2 M グリシン-HCl (pH 2.7) を添加して結合抗体を溶出し、その後 1 M Tris-HCl (pH 8.0) で直ちに中和しました。 。 この溶液を 10 mM HEPES-NaOH (pH 7.4) に対して透析し、タンパク質の純度を SDS-PAGE で分析しました。

preS1 ドメイン (残基 1 ～ 56) をコードする DNA フラグメントを pGEX-2T (GE Healthcare) プラスミドにクローニングし、タンパク質を大腸菌 BL21(DE3) 株 (NEB) 内で 18 °C で生成させました。 N末端にグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）を有する融合タンパク質。 細胞溶解物を緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ）中で調製し、清澄化した上清をＧＳＴＢｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ）上にロードした。 GST-preS1 ドメインを、追加の 10 mM 還元グルタチオンを含む同じバッファーで溶出し、Superdex 75 Increase 10/300 GL (GE Healthcare) サイズ排除カラムを使用してさらに精製し、34 μM まで濃縮しました。

sCageHA_267-1S および sCageHA_267-1S(E99Y/T144Y) は、(His)10 タグ付きシステイン プロテアーゼ ドメイン (CPD) 由来の融合タンパク質として大腸菌 LEMO21(DE3) 株 (NEB) で 18 °C で発現されました。 C末端のコレラ菌49由来。 タンパク質は、HisPur ニッケル樹脂 (Thermo)、HiTrap Q 陰イオン交換カラム (GE Healthcare)、および HiLoad 26/60 Superdex 75 ゲル濾過カラム (GE Healthcare) を使用して精製しました。 セレノメチオニン (SelMet) 標識の場合、I30M 変異を追加して導入し、sCageHA_267-1S(E99Y/T144Y/I30M) バリアントを生成しました。 このタンパク質を、ＳｅＭｅｔを含む最少培地中で大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）ＲＩＬ株（Ｎｏｖａｇｅｎ）において発現させ、他の変異体を精製するための同じ手順に従って精製した。

好ましい結晶充填相互作用を誘導するために、2 つの点突然変異 (Glu99Tyr および Thr144Tyr) が導入されました。 sCageHA_267-1S(E99Y/T144Y/I30M) の高品質の単結晶は、11% (v/v) エタノール、0.25 M NaCl、0.1 M を含む溶液にマイクロシードすることにより、ハンギング ドロップ蒸気拡散設定で得られました。トリス-HCl (pH 8.5)。 結晶は温度を 25 °C に厳密に維持する必要がありました。 凍結保護のために、結晶を15% 2,3-ブタンジオールを添加した結晶化溶液に短時間浸漬し、液体窒素中で瞬間冷却した。 単一波長の異常分散データセットが Se 吸収ピークで収集され、HKL200050 で処理されました。 Se の位置と初期電子密度マップは、PHENIX51 の AutoSol モジュールを使用して計算されました。 モデルの構築と構造の改良は、COOT52 と PHENIX を使用して実行されました。

サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。 データ分析から除外されたサンプルはなく、盲検化も行われませんでした。 匿名化された臨床血清サンプルは、標的タンパク質のスパイクにランダムに使用されました。 結果は、異なる日に純粋なタンパク質の異なるバッチを使用して首尾よく再現されました。 特に明記しない限り、データは平均値±標準偏差として示され、図中の誤差バーは技術的な三重測定の標準偏差を表します。 生物層干渉計データは、ForteBio Data Analysis Software バージョン 9.0.0.10 を使用して分析されました。 すべてのデータは、GraphPad Prism 8 を使用して分析およびプロットされました。

研究デザインの詳細については、この論文にリンクされている Nature Research Reporting Summary を参照してください。

sCageHA_267-1S の原子座標は、アクセッション コード 7CBC で PDB に登録されています。 この研究の発見を裏付ける元の実験データは、要求に応じて対応する著者から入手できます。 この記事で説明されているバイオセンサータンパク質をコードするプラスミドは、リクエストに応じて対応する著者から入手できます。

原稿で使用されている設計モデルと RosettaScript コードは、http://files.ipd.uw.edu/pub/de_novo_design_of_tunable_biosensors_2021/designcode_and_models.zip に保管されています。 この原稿に示されている数値シミュレーションのコードは、http://files.ipd.uw.edu/pub/de_novo_design_of_tunable_biosensors_2021/model_simulation.py で入手できます。

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ええ、H.-W. 他。 in vivo イメージングを向上させる ATP 非依存性生物発光レポーターのバリアント。 ACS Chem. バイオル。 14、959–965 (2019)。

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私たちは、HHMI (DB)、LG Yonam Foundation (B.-HO)、韓国の BK21 PLUS プロジェクト (HL)、新興感染症研究センター「CREID」の 1 つである世界抗ウイルス研究ネットワーク (UWARN) からの資金提供を認めます。 、NIAID 1 U01 AI151698-01 (DB、LS および H-.WY)、タンパク質設計研究所の大胆なプロジェクト (DB、H-.WY、CMC および MCM)、シュミット フューチャーズの推薦によるエリック シュミットとウェンディ シュミット(AQ-.R. および H-.WY)、ワシントン研究財団 (JP および MJL)、ノードストロームバリア研究所タンパク質設計ディレクター基金 (RAL)、タンパク質設計改善基金 (DB および SEB)、 Gree Real Estate (AQ-R.)、「la Caixa」財団 (AQ-R.、助成金 LCF/BQ/AN15/10380003 に基づく ID 100010434)、サポート 1U19AG065156-01 (DB)、および空軍事務所からのギフト サポート科学研究部門 FA9550-18-1-0297 (DB)。 匿名化されたヒト血清標本を収集してくれた M. Wener 氏、抗 SARS-CoV-2 抗体センサーに関するアドバイスと支援をくれた WC Van Voorhis 氏、模擬鼻マトリックスを提供してくれた N. Panpradist 氏と B. Lutz 氏、S. Berger 氏に感謝します。 BCL-2タンパク質ターゲットを共有し、ボツリヌス神経毒Bの提供にはDA Silva Manzano、スクリーニング用クリスタルトレイのセットアップにはA. Kang、SARS-CoV-2 RBDの提供にはL. Carter、B. Fialaおよびタンパク質設計研究所が協力した。スパイクプロテイン。 ルシフェラーゼ活性のサンプル間の変動を制御するための内部 BRET 参照を提案してくださった M. Merkx に感謝します。 X 線データは、韓国の浦項加速器研究所のビームライン 5C で収集されました。 すべてのタンパク質の構造とモデルの画像は、PyMOL 2.0 を使用して生成されました。

パク・ジュヨン

現在の住所：Sana Biotechnology, Inc、米国ワシントン州シアトル

ロバート・A・ランガン、スコット・E・ボイケン、マーク・J・ラジョイエ

現在の住所：Outpace Bio, Inc.、米国ワシントン州シアトル

次の著者も同様に貢献しました: Alfredo Quijano-Rubio、Hsien-Wei Yeh

米国ワシントン州シアトル、ワシントン大学タンパク質設計研究所生化学部

アルフレド・キハノ＝ルビオ、シェンウェイ・イェ、ジュヨン・パーク、ロバート・A・ランガン、スコット・E・ボイケン、マーク・J・ラジョイ、ロンシン・カオ、キャメロン・M・チョウ、マーク・C・ミランダ、ランス・スチュワート、ビョンハ・オ、デヴィッドベイカー

ワシントン大学生物工学部、シアトル、ワシントン州、米国

アルフレッド・キハノ・ルビオ

韓国科学技術院、KAIST 生物世紀研究所、生物科学部、大田、韓国

ハンソル・イ＆オ・ビョンハ

韓国、春川、江原国立大学生物医科学部システム免疫学科

ジミン・ウィ＆ヒョ・ジョンホン

ワシントン大学ハワード・ヒューズ医学研究所、シアトル、ワシントン州、米国

デビッド・ベイカー

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DBが作品を監督しました。 DB、AQ-R.、H.-WY、B.-HO、JP、LS は研究を設計し、さらに概念化しました。 AQ-R.、JP、B.-HO、および H.-WY はセンサーの計算設計を実行しました。 AQ-R.、JP、B.-HO は初期のセンサー設計を調査しました。 H.-WY および AQ-R。 センサーの設計を最適化して性能を向上させ、実験による特性評価を実施しました。 H.-WY および AQ-R。 実験的な検証を行った。 BHO が指揮し、HL が結晶学的研究を実施しました。 H.-WY と RAL は熱力学モデルを作成し、シミュレーションを実行しました。 RAL は GraftSwitchMover を作成しました。 SEB と MJL は、親ケージと主要なタンパク質足場を設計しました。 LC は RBD バインダー LCB1 を設計しました。 CMC、MCM、JW、および HJH はタンパク質の精製を実行しました。 DB、B.-HO、AQ-R. H.-WY が原案を書きました。 著者全員が原稿を確認し、受理しました。

オ・ビョンハ氏またはデヴィッド・ベイカー氏との通信。

DB、AQ-R.、H.-WY および JP は、この記事で説明されているバイオセンサーを対象とする仮特許出願 (ワシントン大学により提出された出願番号 63/030,836) の共同発明者です。 DB、AQ-R.、H.-WY、LC、および LS は、この記事で説明されている SARS-CoV-2 RBD バイオセンサーを対象とした仮特許出願 (ワシントン大学により提出された出願番号 63/051549) の共同発明者です。 。 残りの著者は競合する利益を宣言していません。

査読情報 Nature は、Caryn Bern 氏、Vincent Hilser 氏、およびその他の匿名の査読者の、この研究の査読への貢献に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a〜e、Kopen（a）、KLT（b）、[lucKey]tot（c）、[lucCage]tot（d）およびKopen（e）のさまざまな値に対する図1bに示す連成平衡の数値シミュレーション。 特に指定のない限り、シミュレーションは、Kopen = 1 × 10−3 M、KLT = 10−9 M、および KCK = 10−8 M の固定値、およびセンサー成分の濃度を 10:100 nM に設定して実行されました ([ lucCage]tot:[lucKey]tot)。 a, ΔGopen を増加させる (Kopen を小さくする) と、センサーの応答がより高い検体濃度にシフトします。 b、センサー LOD は約 0.1 × KLT です。 この濃度以下ではスイッチを開く駆動力が弱くなりすぎます。 c、d、有効ターゲット検出範囲は、2 つのセンサーコンポーネントの濃度を変更することで調整できます。 ターゲット濃度の対数スケール (c) または線形スケール (d) で示されたシミュレーション結果は、応答の急峻さがセンサー濃度とラッチ-ターゲット結合相互作用 (KLT) の比に依存することを示しています。 e、KCK 値は、バックグラウンドとシグナルの原因となる種 (それぞれ図 1b の種 6 と 7) の両方に影響を及ぼし、センサーのダイナミック レンジが異なります。 f、g、さまざまな Kopen および KCK 値を使用したシミュレーション。 種6（図1b）の形成は、大きなKopen値と強いlucCage-lucKey相互作用（KCK）によって増加します。 f、Kopen および KCK の値に従って計算されたセンサーのダイナミック レンジを表すヒート マップ。 Kopen はダイナミック レンジに優れた効果を発揮し、KCK はさらに 1 次の調整可能性を提供します。 g. 飽和標的濃度での再構成ルシフェラーゼの割合 (感度) を示すヒート マップ。KCK 調整のトレードオフを示します。

a、de novo LOCKR スイッチ (青) のラッチ ヘリックス上の SmBiT (金) と BIM ペプチド (サケ) の異なるねじ切り位置を示すタンパク質モデル。 b. 11 個の de novo BCL-2 センサーの実験的スクリーニング。 11 個の変異体は、SmBiT と BIM の位置を組み合わせることによって生成され、BCL-2 の添加後の発光の活性化によって特徴付けられました。 発光測定は、BCL-2 (200 nM) の存在下または非存在下で、各デザイン (20 nM) およびlucKey (20 nM) で実行されました。 SmBiT312-BIM339 (したがって、lucCageBIM) は、輝度、ダイナミック レンジ、安定性が高いため、事後特性評価に選択されました。 c – g、lucCageBIM の特性評価。 c、リボン表現の構造設計モデル。 d、SmBiT (金) とケージ (青) の予測された界面を示す拡大図。 e、BIM (サケ) とケージ (青) の予測された境界面を示す拡大図。 f、lucCageBIM（20nM）とlucKey（20nM）の混合物にBCL-2（200nM）を添加した後の動力学的発光測定。 g、センサー (lucCageBIM および lucKey) コンポーネントの濃度を変更することによる、BCL-2 に対する lucCageBIM の調整可能な感度 (色付きの曲線)。

a、de novo バインダー HB1.9549.2 が埋め込まれた sCageHA 設計の構造モデル。 HB1.9549.2 タンパク質 (シアン) は、連続する 3 つのグリシン残基 (緑色) を含む、ラッチ ヘリックス (マゼンタ) に沿った異なる位置で親の 6 ヘリックス バンドル (sCage、黄色) にグラフトされました。 黒い矢印は、ラッチ上にさらに導入された単一 V255S (1S) または二重 V255S/I270S (2S) 変異を示します。 b、生物層干渉法による、キーの存在下または非存在下でHAに結合する5つのsCageHA設計の実験的検証。 sCagesとkeyの濃度はそれぞれ1μMと2μMであった。 各実験は 1 回ずつ実行されました。 sCageHA_267-1S は最も高い活性化倍率を示しました。 c、HB1.9549.2のケージングを可能にするsCageの柔軟な性質を示す構造比較。 sCageの構造モデル（灰色）とsCageHA_267-1Sの結晶構造（金色）を重ね、細断面（黒色のボックス）を詳細に表示します。 HB1.9549.2のN末端ヘリックスはラッチヘリックス(α6)から3.2Å変位しており(中央)、α5も同時に変位し、sCageのQ16とN214が関与する水素結合ネットワークが部分的に破壊されている(右)。 d、sCageHA_267-1Sの分子内相互作用の拡大図。 HA 結合残基はマゼンタで強調表示されています。 HB1.9549.2 の N 末端ヘリックス (シアン α1) とそれに続くヘリックス (シアン α2) の両方がケージと相互作用します。 分子内相互作用はすべて疎水性です。 F285のかさばる疎水性側鎖は、sCageのα5の主鎖原子にしっかりと隣接していますが、これはα5が曲がっていなければ起こりそうにありません。 好ましくない相互作用も見つかりました。F273 は溶媒にさらされ、Y287 ヒドロキシル基は無極性環境に埋もれています。 一番右のパネルは電子密度マップの品質を示しています。

a、lucCage (青) のラッチ上の Bot.0671.2 (緑、PDB コード 5VID) のさまざまなねじ位置を示す BoNT/B センサー設計の構造モデル。 SmBiT ペプチドは金色のリボンで示されています。 I328S および L345S は、ラッチ-ケージ界面を調整するために導入された変異を示します (「1S」は I328S を示し、「2S」は I328S/L345S を示します)2。「GGG」は、ラッチとグラフトされたタンパク質の間に 3 つの連続するグリシン残基が存在することを示します。 黒いボックスは、349_2S デザインのケージ (青) と Bot.0671.2 (緑) のインターフェースの拡大図を示しています。 b. 9 つの新規 BoNT/B センサーの実験的スクリーニング。 発光測定は、BoNT/B タンパク質 (200 nM) の存在下または非存在下で、各デザイン (20 nM) および lucKey (20 nM) について実行されました。 各設計の発光値は、BoNT/B の非存在下で 100 に正規化されました。 デザイン 349_2S は、高い感度と安定性により最良の候補として選択され、lucCageBot と名付けられました。 c、lucCageBot の感度の決定。 生物発光は、段階希釈した BoNT/B タンパク質の存在下で 6,000 秒にわたって測定されました。 lucCageBot:lucKey の濃度 (nM) は、(上から下へ) 50:5、5:5、1:10、および 0.5:0.5 でした。 d、さまざまな濃度でのセンサーの LOD 計算。 lucCageBot:lucKey の濃度 (nM) は、(上から下へ) 50:5、5:5、1:10、および 0.5:0.5 でした。 すべての実験は 3 回実行され、代表的なデータが示されています。データは平均値 ± SD です。

a、lucCage (青) のラッチ上の黄色ブドウ球菌プロテイン A ドメイン C (オレンジ、PDB コード 4WWI) のさまざまな貫通位置を示す Fc センサー設計の構造モデル。 SmBit ペプチドは金色のリボンで示されています。 I328S および L345S は、拡張データ図 4a のように、ラッチ ケージ インターフェースを調整するために導入された突然変異を示します。 b、6つのde novo Fcドメインセンサーの実験的スクリーニング。 組換えヒトIgG1 Fc (200 nM)の存在下または非存在下で、各設計(20 nM)およびlucKey (20 nM)について発光測定を実施した。 発光値は、Fcの非存在下で100に正規化されました。 デザイン 351_2S は感度が高いため最良の候補として選択され、lucCageProA と名付けられました。 この実験は 2 つの独立したインスタンスで単一の複製を使用して実行され、代表的なデータが示されています。 c、lucCageProAの感度の決定。 生物発光は、段階希釈した Fc タンパク質の存在下で 6,000 秒にわたって測定されました。 lucCageBot:lucKey 濃度 (nM) は、5:5 (上)、1:10 (中央)、および 0.5:0.5 (下) でした。 d、さまざまな濃度でのセンサーの LOD 計算。 lucCageBot:lucKey 濃度 (nM) は、5:5 (上)、1:10 (中央)、および 0.5:0.5 (下) でした。 e、aと同様に、lucCage（青）のラッチ上のHER2アフィボディタンパク質（PDBコード3MZW、ベージュ）のさまざまなスレッド位置を示すHER2センサー設計の構造モデル。 黒いボックスは、354_2S デザインにおけるケージ (青色) と HER2 アフィボディ (ベージュ) の境界面の拡大図を示しています。 f、7 つの新規 HER2 センサーの実験的スクリーニング。 HER2の細胞外ドメイン(200nM)の存在下または非存在下で、各設計(20nM)およびlucKey(20nM)について発光測定を行った。 発光値は、HER2 細胞外ドメインの非存在下で 100 に正規化されました。 この実験は 2 つの独立したインスタンスで単一の複製を使用して実行され、代表的なデータが示されています。 デザイン 354_2S は、高い感度と安定性により最良の候補として選択され、lucCageHER2 と名付けられました。 g、lucCagerHER2の感受性の決定。 生物発光は、段階希釈した HER2 外部ドメインタンパク質の存在下で 6,000 秒にわたって測定されました。 lucCageBot:lucKey 濃度 (nM) は、5:5 (上)、1:10 (下)、0.5:0.5 (下) でした。 h、さまざまな濃度でのセンサーの LOD 計算。 lucCageBot:lucKey 濃度 (nM) は、5:5 (上)、1:10 (中央)、および 0.5:0.5 (下) でした。 特に示されない限り、すべての実験は 3 回実行され、代表的なデータが示されており、データは平均値 ± SD です。

a、cTnI用に設計されたセンサーの実験的スクリーニング。 cTnT のフラグメント、つまり cTnTf1 ～ f6 は、ラッチの異なる位置で lucCage にコンピューターによってグラフトされました。 すべてのデザインは大腸菌で生成され、100 nM cTnI の存在下での発光の増加について 20 nM および 20 nM lucKey で実験的にスクリーニングされました。 発光値は、cTnI の非存在下で 100 に正規化されました。 この実験は 2 つの独立したインスタンスで単一の複製を使用して実行され、代表的なデータが示されています。 設計 336-cTnTf6-K342A は、感度、活性化倍数変化、および安定性に基づいて最良の候補 (lucCageTrop627 と命名) として選択されました。 b、lucCageTrop627のモデルおよびlucCageTrop - lucCageTrop627のC末端でのcTnCの融合によって生成される改良型。 モデルは、SmBit (金)、cTnT (シアン) (PDB コード 4Y99) のフラグメント、および cTnC (緑) (PDB コード 4Y99) を含むリボン表現で示されています。 黒いボックスは、lucCageTrop 設計におけるケージ (青) と cTnT (シアン) の界面の拡大図を示しています。 c、lucCageTrop627およびlucCageTropのcTnIに対する結合親和性を生物層干渉法により測定した。 lucCageTrop は、lucCageTrop627 よりも cTnI に対して 7 倍高い親和性を示しました。 d、段階希釈したcTnIの存在下でのlucCageTrop627（上）とlucCageTrop（下）の間の生物発光反応速度の比較。 結合親和性が高いと、センサーのダイナミック レンジと感度が向上します。 e, lucCageTrop の感度の決定。 生物発光は、段階希釈した cTnI の存在下で 6,000 秒にわたって測定されました。 lucCageTrop:lucKey 濃度 (nM) は、(上から下へ) 1:10、1:1、0.5:0.5、および 0.1:0.1 でした。 f、さまざまな濃度でのセンサーの LOD 計算。 lucCageTrop:lucKey 濃度 (nM) は、1:10、1:1、0.5:0.5、および 0.1:0.1 (上から下) でした。 特に指示がない限り、すべての実験は 3 回実行され、代表的なデータが示されており、データは平均値 ± SD です。

a、lucCage デザインのエネルギー最小化モデルは、SmBiT のネジ付きセグメント (金色) と preS1 の抗原モチーフ (マゼンタ) で示されています。 右のボックスは、HBV344 設計のケージとモチーフの境界面の拡大図を示しています。 ｂ、抗ＨＢＶ抗体ＨｚＫＲ１２７－３．２（１００ｎＭ）の存在下または非存在下で各ｌｕｃＣａｇｅ（２０ｎＭ）およびｌｕｃＫｅｙ（２０ｎＭ）の発光をモニタリングすることによって行われたすべての設計の実験的スクリーニング。 抗HBVの非存在下での発光値を100に正規化した。 この実験は 2 つの独立したインスタンスで二重に実行され、代表的なデータが示されています。 設計 HBV344 は、その優れたパフォーマンスにより選択され、lucCageHBV と名付けられました。 c、d、lucCageHBV感受性の決定。 生物発光は、段階希釈した HzKR127-3.2 の存在下で 6,000 秒にわたって測定されました。 lucCageHBV:lucKey 濃度は 5:5 nM (上) および 1:1 nM (下) でした。 d の曲線の最大値は、c の曲線を取得するために使用されます。 e、さまざまな濃度でのセンサーの LOD 計算。 lucCageHBV:lucKey 濃度は 5:5 nM (上) および 1:1 nM (下) でした。 f、図3fに示すlucCageHBV344とHzKR127-3.2の競合によるpreS1の検出。 抗体添加後の発光動態（抗HBV、最初の矢印）。 抗 HBV 抗体濃度は 50 nM (上) および 12.5 nM (下) でした。 6,000 秒で、さまざまな濃度の preS1 ドメインがウェルに注入され (2 番目の矢印)、減少した発光シグナルを使用して preS1 を検出しました。 g、抗HBV抗体の検出を改善するためのlucCageHBVαの設計。 lucCageHBVα の構造モデルは、preS1 エピトープ (マゼンタ) と lucCage (青) の間の予測される界面の拡大詳細とともに示されています。 このデザインは、抗体との二価相互作用を可能にするために柔軟なリンカー (灰色) によって間隔をあけられたエピトープ preS1 (アミノ酸 35 ～ 46) の 2 つのコピーで構成されます。 SmBit ペプチドは金色で示されています。 ｈ、抗体ＨｚＫＲ１２７－３．２（抗ＨＢＶ）の存在に対するｌｕｃＣａｇｅＨＢＶα検出感度の決定。 生物発光は、段階希釈した HzKR127-3.2 の存在下で 6,000 秒にわたって測定されました。 lucCageHBVα:lucKey 濃度 (nM) は 1:10 (上) および 0.5:0.5 (下) でした。 i. 検量線の直線領域を使用して、抗体検出の LOD を決定しました。 j、BioRad ChemiDoc イメージング システムで取得した生物発光画像。 lucCageHBVα:lucKey 濃度 (nM) は、50:5 (上)、5:5 (中央)、および 1:10 (下) です。 生物発光レベルの変化は、HzKR127-3.2 の濃度の関数として検出されました。 特に示されていない限り、すべての実験は 3 回実行され、代表的なデータは平均値 ± SD です。

a、b、SARS-CoV-2膜タンパク質（a）およびヌクレオカプシドタンパク質（b）に対する抗体のde novoセンサーの実験的スクリーニング。 膜タンパク質 (M1、M3、および M4) およびヌクレオカプシドタンパク質 (N6 および N62) の選択されたエピトープは、ラッチの異なる位置で lucCage にコンピューターによってグラフトされました。 各設計は、抗体の二価結合を利用するために、柔軟なリンカーによって分離された各エピトープの 2 つのタンデム コピーで構成されました。 すべてのデザインは、抗 M ウサギ ポリクローナル抗体 (a) または 100 nM の抗 N マウス モノクローナル抗体 (クローン 18F629.1) の存在下で、各 lucCage デザインの 20 nM および lucKey の 20 nM での発光の増加について実験的にスクリーニングされました。 ) (b)。 これらの実験は、2 つの独立したインスタンスで 2 回 (a) または 1 回の反復 (b) で実行され、代表的なデータが示されています。 抗体の非存在下での発光値を 100 に正規化しました。 設計 M3_1-17_334 および N62_369-382_340 は、高い感度と安定性により最良の候補として選択され、それぞれ lucCageSARS2-M および ucCageSARS2-N と命名されました。 c、左、lucCageSARS2-Mの構造モデル。M3エピトープ(赤)とlucCage(青)の間の予測界面の拡大図を示しています。 中央、抗 M ポリクローナル抗体に対する lucCageSARS2-M 感受性の測定。 生物発光は、連続希釈した抗 M ポリクローナル抗体の存在下で 4,000 秒にわたって測定されました。 lucCageSARS2-M:lucKey 濃度 (nM) は 50:50 (上) および 5:5 (下) でした。 そうです、さまざまな濃度でのセンサーの LOD の計算です。 d、左、lucCageSARS2-Nの構造モデル。N62エピトープ(紫)とlucCage(青)の間の予測界面の拡大図を示しています。 中央、抗 N モノクローナル抗体に対する lucCageSARS2-N 感受性の測定。 生物発光は、連続希釈した抗 N 抗体の存在下で、lucCageSARS2-N と 50 nM の lucKey について 4,000 秒にわたって測定されました。 そうです、センサーの LOD 計算です。 特に示されない限り、すべての実験は 3 回実行され、代表的なデータが示されており、データは平均値 ± SD です。

a、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のRBDに対するde novoセンサーの実験的スクリーニング。 すべてのデザインは、200 nM RBD の存在下で、各 lucCage デザインの 20 nM および lucKey の 20 nM での発光の増加について実験的にスクリーニングされました。 発光値は、RBD の非存在下で 100 に正規化されました。 この実験は 2 つの独立したインスタンスで二重に実行され、代表的なデータが示されています。 設計 lucCageRBDdelta4_348 が、高い感度と安定性により最良の候補として選択され、lucCageRBD と命名されました。 b、ケージ化されたSmBiTフラグメント（金）を含むlucCage（青）にグラフトされたLCB1バインダー（マゼンタ）からなるlucCageRBDの構造モデル。 黒いボックスは、lucCageRBD デザインにおけるケージ (青) と LCB1 バインダー (マゼンタ) の界面の拡大図を示しています。 c、lucCageRBDの感度の決定。 生物発光は、段階希釈した RBD タンパク質の存在下で 10,000 秒にわたって測定されました。 lucCageRBD:lucKey の濃度 (nM) は、1:1 (上)、1:10 (中央)、および 10:10 (下) でした。 d、さまざまな濃度でのセンサーの LOD 計算。 lucCageRBD:lucKey 濃度 (nM) は 1:1 (上)、1:10 (中央)、および 10:10 (下) でした。 e、BioRad ChemiDoc イメージング システムで取得した生物発光画像。 生物発光レベルの変化は、1 nM lucCageRBD および 10 nM lucKey を使用した RBD 濃度の関数として検出されました。 f、10%模擬鼻マトリックスにおけるRBDの検出。 左は、連続希釈した RBD タンパク質の存在下で生物発光を長時間にわたって測定したものです。 そうです、LOD は 12 pM と計算されました。 g. 20% に希釈したプール血清中のスパイクタンパク質の検出。 左は、連続希釈した HexaPro スパイクタンパク質の存在下で生物発光を長時間にわたって測定したものです。 そうです、LOD は 47 pM と計算されました。 特に指示がない限り、すべての実験は 3 回実行され、代表的なデータが示されており、データは平均値 ± SD です。

a、b、単量体 SARS-CoV-2 RBD を検出するための、lucCageRBD のダイナミック レンジ (DR) に対する lucKey 長さ (KCK) の影響の実験的評価。 短縮された lucKey (短い lucKey) は、C 末端で全長キー (b) よりも 14 残基短く、バックグラウンド シグナルが減少するため、全長 lucKey (a) よりも優れたダイナミック レンジを提供します。拡張データ図 1f、LOD は同じままです。 c. lucKey 濃度がダイナミック レンジに及ぼす影響。 lucKey の濃度を下げると、バックグラウンド シグナルが減少するため、lucCageRBD のダイナミック レンジが増加しますが、それに伴う最大生物発光シグナルも減少します。 d、e、lucCageRBD (1 nM) を 20 nM RBD (d) または 20 nM スパイクタンパク質 (e) とインキュベートしました。これにより、ルシフェラーゼ活性が完全に再構成されることが期待されます。 スパイクタンパク質の存在下では、同じセンサーは最大の生物発光シグナルを生成できませんでした。これは、完全なルシフェラーゼ再構成に対する立体障害など、シミュレーションでは捕捉されなかった要因の影響を示唆しています。 f、50nMのHBV抗体HzKR127-3.2とともにインキュベートしたlucCageHBVα(1nM)は、ほぼ完全な活性化を示すが、高いバックグラウンドシグナルを示す。 g、lucCageTrop (1 nM) は、20 nM cTnI の存在下で、理想的ではないバックグラウンド シグナルと中程度の標的駆動型活性化を示します。 すべての実験は 3 回実行され、代表的なデータが示されています。データは平均値 ± SD です。

a, さまざまな濃度の RBD に応答した lucCageRBD の生物発光スペクトル (左)。 Antares2 は、590 nm (中央) にピーク発光を持つ効率的な CyOFP1-teLuc-CyOFP1 BRET システム 40 です。 発光スペクトルは、lucCageRBD と lucKey (両方とも 1 nM)、Antares2 (0.1 nM)、およびさまざまな濃度の RBD の混合物から記録されました (右)。 470/40 nm および 590/35 nm チャネルから個々のシグナルを取得することにより、lucCageRBD からの強度測定応答がレシオメトリック読み取り値に変換されました。 b、スペクトル非混合比を計算する式。 470/40 nm チャネルからの合計シグナル (T470) は、lucCageRBD センサー (I470) と Antares2 リファレンス (R470) からのシグナルの合計であり、590/35 nm チャネルからの合計シグナル (T590) は等しいです。センサー信号 (I590) と基準信号 (R590) を加算します。 lucCageRBD は 590/35 nm チャネルで無視できる発光を与えるため、T590 は R590 にほぼ等しい (R590 >> I590)。 R470 は R590 × f であり、Antares2 の所定の定数であるため、非混合比 (I470/R590) は信号取得中にリアルタイムで計算できます。 Antares2 の定数 f は、完全なスペクトルを記録するかフィルター セットから一貫して 0.43 であると決定されました。 c. さまざまな濃度の RBD を 50%、25%、または 10% のプール血清、または 20% の模擬鼻液にスパイクしました。 絶対生物発光強度と発光動力学は、マトリックス阻害効果と基質代謝回転により、マトリックス間で異なりました 53。 対照的に、Antares2 を使用したキャリブレーションでは、安定したレシオメトリック信号 (I470/R590) が得られました。 d、飽和RBD濃度におけるlucCageRBDの生物発光強度(緑の曲線)は、バックグラウンドレベルより約20倍高い。 RBD 濃度の関数として生の比率 (T470/T590) をレポートすると、Antares2 からの 470/40 nm チャネル (R470) での顕著な発光により、センサーのダイナミック レンジ (黒い曲線) が損なわれます。 非混合比率の計算と変換後、ダイナミック レンジはレシオメトリック読み出しのバックグラウンド レベルより 20 倍高くなります (マゼンタ曲線)。 e. 4 つの異なる匿名化ヒト血清中のスパイク RBD の検出 (50%) は、スペクトル分解された Antares2 を内部標準として使用するキャリブレーションにより、これらのマトリックスにおける強度測定生物発光の変動を最小限に抑えることができることを示しています。 生物発光シグナルと標準偏差は 3 回測定され、代表的な信号がそれぞれ発光スペクトルと発光速度論として示されています。 データは平均値±標準偏差です

このファイルには、補足説明、補足方法、補足参考文献、補足図 1、および補足表 1 ～ 6 が含まれています。

転載と許可

Quijano-Rubio, A.、Yeh, HW.、Park, J. 他モジュール式で調整可能なタンパク質バイオセンサーの新規設計。 ネイチャー 591、482–487 (2021)。 https://doi.org/10.1038/s41586-021-03258-z

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受信日: 2020 年 6 月 13 日

受理日: 2021 年 1 月 19 日

公開日: 2021 年 1 月 27 日

発行日: 2021 年 3 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-03258-z

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