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Apr 30, 2023

シュウ酸塩トランスポーターOxlTの構造と機構

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 14、記事番号: 1730 (2023) この記事を引用

2494 アクセス

54 オルトメトリック

メトリクスの詳細

腸内細菌叢内のシュウ酸分解細菌は食物由来のシュウ酸を吸収し、これを炭素源およびエネルギー源として利用し、それによって宿主動物における腎臓結石形成のリスクを軽減します。 細菌のシュウ酸トランスポーター OxlT は、他の栄養カルボン酸塩と厳密に区別しながら、腸から細菌細胞にシュウ酸塩を選択的に取り込みます。 今回我々は、シュウ酸結合OxlTとリガンドフリーOxlTの結晶構造を、閉塞状態と外向き状態という2つの異なる立体構造で提示する。 リガンド結合ポケットには、シュウ酸塩と塩橋を形成する塩基性残基が含まれており、酸性基質なしでの閉塞状態への立体構造の切り替えを防ぎます。 閉塞されたポケットはシュウ酸塩を収容できますが、代謝中間体などのより大きなジカルボン酸塩は収容できません。 ポケットからの透過経路は広範なドメイン間相互作用によって完全に遮断されており、基質に隣接する単一の側鎖の反転によってのみ開くことができます。 この研究は、好ましい共生を可能にする代謝相互作用の基礎となる構造的基盤を示しています。

シュウ酸塩は、野菜、豆、ナッツ 2 などのシュウ酸塩を含む食品 1 から毎日の食事を通じて摂取される最小のジカルボン酸塩 (C2O42-) です。 シュウ酸塩は私たちの体内の最終代謝産物でもあり、一部は体循環を介して腸に分泌されます1。 その後、腸管から吸収され、腎臓から排泄されます3。 しかし、過剰なシュウ酸塩は血中カルシウムと不溶性の塩を形成し、腎臓結石症を引き起こします（図1a）。 Oxalobacter formigenes は腸内のシュウ酸分解細菌 4 で、腸内のシュウ酸塩を代謝的に分解することができるため、ヒトを含む宿主動物のシュウ酸塩恒常性に大きく貢献します 3,5,6。 実際、嚢胞性線維症 7 または炎症性腸疾患 8 の患者、または空腸回腸バイパス手術を受けた患者 9 は、O. formigenes の定着率が低く、高シュウ酸尿症および腎臓結石形成のリスクが高いことが知られています。

a 腸内のシュウ酸分解細菌、O. formigenes における OxlT 機能の概略図。 b、c シュウ酸結合型 (PDB ID 8HPK; b) およびリガンド非結合型 (PDB ID 8HPJ; c) OxlT の結晶構造。 d シュウ酸結合OxlTとリガンドを含まないOxlTの重ね合わせ。 ペリプラズムからの図 (上) と膜貫通面での 2 つの図 (下) が示されています。 e、f シュウ酸結合 (e) およびリガンド非結合 (f) OxlT の表面静電ポテンシャル マップ。 ±5 kTe-1 の静電ポテンシャルを表面にマッピングしました。

O. formigenes のシュウ酸塩:ギ酸アンチポーター (OFA)10 であるシュウ酸トランスポーター (OxlT) は、この細菌におけるシュウ酸代謝の重要な分子です。 OxlT は、C2 ジカルボン酸、シュウ酸に対して最適化された基質特異性を備えた電気化学的勾配に従って、細胞膜を通過するカルボン酸の対向ポートを触媒します。 実際、トランスポーターはシュウ酸自己交換の高い代謝回転率 (>1000/秒) を示します 11,12。 シュウ酸独立栄養生物 O. formigenes の生理学的条件下では、OxlT のカルボン酸交換機能により、細菌の唯一の炭素源として宿主の腸からシュウ酸が取り込まれ、シュウ酸の最終分解生成物であるギ酸 (HCO2-) が放出されます。これは細菌細胞に蓄積すると有毒です11、12、13（図1a）。 OxIT の触媒によるシュウ酸塩:ギ酸塩交換の代謝回転には、細胞質ゾル内のプロトンを消費するデカルボキシラーゼを介したシュウ酸塩のギ酸塩への代謝分解が伴い、その結果、細菌の細胞膜を横切るプロトンの電気化学的勾配が生じます 11。 したがって、OxlT は、細菌の ATP 合成のためのプロトン原動力を生み出す「仮想プロトン ポンプ」として機能します 11。 したがって、各化学物質のユニポーターではなく、シュウ酸塩とギ酸塩の間のアンチポーターとしてのOxlTの機能的特徴は、炭素代謝とエネルギー生成を結び付けるために不可欠です。 特に、OxlT は、クレブス回路ジカルボン酸中間体であるオキサロ酢酸 (C4H2O52-) またはコハク酸 (C4H4O42-) を基質として受け入れません 13。 これら 4 つの炭素原子を持つジカルボキシレート (C4 ジカルボキシレート) は、細菌のサイトゾル側で重要な代謝中間体であると同時に、宿主内腔側の腸内トランスポーターを介してエネルギー源および生合成前駆体としても吸収されます 14。 したがって、C2 ジカルボン酸と C4 ジカルボン酸を識別する OxlT の能力は、宿主動物と腸内細菌の間の良好な共生にとって重要です。

OxlT は、主要な促進因子スーパーファミリー (MFS) に属します。これは、そのメンバーが幅広い化学物質を輸送する大規模な輸送体ファミリーです 10。 MFS タンパク質は、6 つの遺伝子重複 TM ユニットの対称的な N 末端と C 末端の半分を含む 12 の膜貫通 (TM) ヘリックスの共通の構造を共有しており、分子の中心に基質結合部位があります 15,16。 MFS ファミリーおよび他のトランスポーターファミリーの基質輸送機構は、「交互アクセスモデル」17 によって説明されます。このモデルでは、トランスポーター分子が結合部位から膜のどちらかの側に交互に空洞を開け、外側に向きます。 N および C 末端ドメインの「ロッカー スイッチ」運動を介して閉塞された内向きの立体構造が形成され、それによって膜を越えた基質の移動が可能になります 18、19、20。 各 MFS メンバーの豊富な構造情報が蓄積されていますが、OFA ファミリーに関する現在の知識は、6.5 Å での電子結晶学によって最初に解明された OxlT 構造に限られています 21,22。 したがって、OxlT の特異的なシュウ酸認識およびアンチポート機構は、より高解像度の構造ではまだ解明されていません。

この研究では、このシュウ酸分解細菌の共生の根底にあるこれらの重要なトランスポーター機能の構造基盤を理解するために、3.0〜3.3Åで解像したシュウ酸結合型およびリガンドフリー型のOxlTのX線結晶構造を報告します。腸。

野生型 OxlT は、塩化物イオンの存在下などのさまざまな条件下で不安定であり 12,23、結晶化スクリーニングに利用できる化学空間が大幅に狭まります。 OxlT の構造研究には、抗体支援結晶化戦略が採用されました。 一般に、膜タンパク質の立体構造エピトープに特異的に結合する Fab または Fv 抗体フラグメントは、硬い結晶格子の形成に利用できる親水性表面積を増加させることができます。 さらに、結合した抗体フラグメントは、タンパク質固有の柔軟性と構造の不均一性を低下させる可能性があり、膜タンパク質の結晶化が成功する可能性が高まります 24、25。 OxlT は、2 つの異なる抗体フラグメントを結合することによって安定化し、2 つの異なる条件下で結晶化をもたらしました。 結晶化に使用された抗体フラグメントは、シュウ酸の存在下と非存在下の両方でOxlTに結合することを確認しました（補足図1）。 したがって、抗体フラグメントが人為的に特定の構造の OxlT を捕捉する可能性は低いです。 Fab フラグメントと複合体を形成したシュウ酸結合 OxlT の結晶構造は 3.0 Å (PDB ID 8HPK) で解析されましたが、Fv フラグメントと複合体を形成したリガンドフリー OxlT の結晶構造は 3.3 Å (PDB ID 8HPJ) で解析されました (補足図) .2a、b、および補足表 1 および 2)。

OxlT の全体構造は、以前の EM 構造 21 で観察され、後に典型的な MFS アーキテクチャとして確認された 15、16 ように、12 の TM ヘリックスで構成されています (図 1b、c)。 シュウ酸結合状態では、OxlT タンパク質は構造の中心にシュウ酸分子が結合した閉塞構造をとります (図 1b、e)。 対照的に、リガンドを含まないOxlTは、シュウ酸結合型とは実質的に異なる立体構造をとる(図1c、d、f)。 OxlT タンパク質は、N ドメイン (TM1 ～ 6) と C 末端ドメイン (TM7 ～ 12) の間に大きな V 字型の空洞を示し、これは中央のシュウ酸結合部位からペリプラズムまで接続されており、これは外向きの構造の明らかな特徴です。 -対面構造。

閉塞構造と外向き構造の比較では、すべての残基の Cα 二乗平均平方根偏差 (RMSD) は 2.6 ～ 2.7 Å でした (図 1d)。 2 つの唯一の N 末端ドメインまたは C 末端ドメインでさえ、かなりの構造的差異を示しました (Cα RMSD は約 1.5 ～ 1.6 Å)。 したがって、「ロッカースイッチ」動作による閉塞状態と外向き状態の間の構造変化は、剛構造ユニットの傾斜によって達成されるのではなく、それらの曲げと同時に起こる。 実際、ペリプラズム部分の顕著な曲がりは、外側に面した構造のTM1、2、4、7、8、および11で観察され、他の周囲のTMヘリックスが傾いています（図1d）。 対照的に、2 つの立体構造間の細胞質部分には目立った違いはありませんでした。 GLUT5 や NarK などの他の MFS タンパク質では、TM ヘリックスのグリシン残基での屈曲が、異なる立体構造状態間で観察されています 26,27。 OxlTには52個のグリシン残基があり、これはアミノ酸含有量の約8分の1（12.4％）です（図1d、補足図2c、dおよび3）。 注目すべきことに、このグリシンの頻度は、LacY (8.6%)、GLUT5 (7.6%)、NarK (10.4%) などの他の MFS タンパク質、および他の膜タンパク質の TM ヘリックス (約 8.7%) の頻度よりも高くなります 28。 したがって、グリシン残基におけるTMヘリックスの屈曲の蓄積は、OxlTの状態間の立体構造の切り替えを達成する際により顕著であると思われる。 グリシン残基は、TM5 と TM8 または TM2 と TM11 のように、N 末端ドメインと C 末端ドメインの間の境界面にも見つかり (補足図 2c、d)、以前に報告されたように緊密ならせん充填を達成しました 28,29。 OxlTで観察される高いグリシンの存在は、輸送される基質としては小さいシュウ酸塩を分子の中心に閉塞するために必要である可能性がある。 逆に、グリシンの豊富な構造は、界面活性剤ミセルにおける OxlT の不安定性の原因である可能性が高く、以下に説明するように、抗体断片や機能アッセイが存在しない場合の結晶化を妨げます。 高いグリシン比は他のOFAタンパク質でも観察され（15の厳密に保存された位置で10.2±1.1％、補足図3に示す11ファミリーメンバーで観察）、これは家族特性である可能性があります。

結晶構造（PDB ID 8HPK）では、OxlTに結合するシュウ酸分子はねじれた構造として精製されています（図2aおよび補足図4a）。 シュウ酸ジアニオンの 2 つのカルボキシル基間の結合は単一で非共役であることが知られており、CC 結合を中心にカルボキシル基が自由に回転できます 30。 シュウ酸結合 OxlT 構造の分解能はシュウ酸の二面角を正確に決定するには不十分であるため、閉塞された OxlT 構造におけるシュウ酸結合の量子力学 (QM) および量子力学/分子力学 (QM/MM) 計算を実行しました。エネルギー的に最小化された立体構造を調べます。 シュウ酸塩の得られたOCCO二面角は50〜68°の範囲内でした（補足図4b、cおよび補足表3）。 これらの値は、元の結晶構造で観察された値 (60.1°) に近く、シュウ酸塩が平面的ではなく、結晶構造内でねじれていることを確認します。

a シュウ酸結合 OxlT の結合部位の拡大図 (PDB ID: 8HPK)。 破線は、潜在的な水素結合と塩橋を示します。 原子ラベルが付いた結合シュウ酸分子の拡大図も示されています。 b 基質と相互作用するアミノ酸残基のトポロジー的類似性に基づく、OxlT（下線付きのラベル付き）とNarK（緑色、通常のラベル付き）の基質結合部位構造の重ね合わせ。 c GFP-TSによるシュウ酸結合アッセイ。 データは、3 つの独立した実験における 3 mM シュウ酸カリウムの添加によって引き起こされた融解温度の上昇の平均 ± SEM を表します。 WT: 野生型。 d 組換え大腸菌細胞を使用したシュウ酸塩取り込みアッセイ。 同日に測定した野生型OxlTの相対輸送活性を100%、OxlT36を発現していない細胞の輸送活性を0%として、変異体OxlTの相対輸送活性を表示する。 バーは、各変異体に対する単一の実験から技術的に複製された測定値の平均を表します。 R272A および K355Q 変異体の結果は、比較のために以前の研究 36 から再掲されています。 e プロテオリポソームシュウ酸取り込みアッセイ。 リポソーム溶解物中の得られたシュウ酸濃度を測定し、60分におけるWT OxlTの濃度に対して正規化した。 OxlT を含まないリポソームの結果は「空」として示されています。 棒は、3 回 (空、WT、および R272A の 0 分および 60 分のデータ) または 2 回 (その他) の独立した実験の結果の平均を表します。 au：任意の単位。 パネル c および e では、データは対照として WT OxlT を使用したダネット検定による両側一元配置分散分析によって分析されました。正確な P 値は補足表 6 に示されています。 *P < 0.05、* *P < 0.01、***P < 0.001。 赤いバーは、以前の研究で活性の損失を示した変異体（または同じ残基での変異）を示します 31、32、34。 f 細胞質への空洞を閉じるドメイン間相互作用。 g OxlT の細胞質側のイオン相互作用ネットワーク。 h キャビティをペリプラズムに閉じるドメイン間相互作用。

OxlTの結合部位では、シュウ酸塩は1つのカルボキシル基でトランスポーターに結合し、TM8のArg272と二座塩橋を形成し、もう1つはTM11のLys355とイオン相互作用を形成します（図2a）。 シュウ酸塩との塩架橋に加えて、Lys355 の ε-アミノ基は、N 末端ドメインの Gln34 (TM1) および Gln63 (TM2) のカルボキサミド基とドメイン間水素結合ネットワークを形成します。 同様に、Arg272 のグアニジノ基は、Ala147 (TM5) の主鎖カルボニル基とドメイン間水素結合を形成し、さらに TM8 の上流にある Asn268 の側鎖カルボキサミドおよび主鎖カルボニル基と相互作用します。 Arg272 の周囲の領域は、N268GGCR272P の配列による TM8 の屈曲点であるため、Arg272 と Asn268 の間の水素結合は、シュウ酸結合構造における TM8 の立体構造と配向を維持すると考えられます。 Arg272 と Lys355 が関与するこれらのドメイン間およびドメイン内水素結合ネットワークは、これら 2 つの塩基性残基が C 末端ドメイン内に位置しているにもかかわらず、結合ポケットの構造を組織化し、閉塞構造を安定化する上で極めて重要な役割を果たしている可能性があります。 これらの2つの塩基性残基はOFAファミリー内で保存されており（補足図3）、シュウ酸輸送に必須であり、R272KまたはK355R変異でさえ輸送活性を低下させます31、32、33。 これらの結果は、電荷だけでなく 2 つの残基の側鎖の化学構造も結合部位の構造組織にとって重要であるという観察を裏付けています。

2 つの塩基性残基に加えて、多数の芳香族残基がシュウ酸結合に寄与することがわかっています。 Tyr35 と Tyr124 のヒドロキシル基は、シュウ酸塩のカルボキシル基のいずれかと水素結合を形成します（図 2a）。 さらに、Tyr150、Trp324、Tyr328、および Trp352 の芳香族側鎖基は、シュウ酸塩のカルボキシル基と面と面または端と面の π-π 相互作用を形成しており、シュウ酸の π 電子系の重要性が示されています。 OxlTによる分子認識。 これらの芳香族残基は N 末端半分と C 末端半分の両方に分布しているため、シュウ酸塩との相互作用もドメイン間空洞の閉鎖を安定化し、閉塞構造を達成します。 さらに、Trp352 (TM11) は Gln66 (TM2) とドメイン間水素結合を形成します。 これらの芳香族残基は、OFAファミリーに属するタンパク質間で保存されています（補足図3）。 実際、以前の研究では、Tyr150 または Trp352 の変異が輸送機能の喪失と関連付けられていました 31,34。 注目すべきことに、硝酸塩/亜硝酸塩ポーター（NNP）ファミリーのNarKによる、やはりπ電子系を持つ硝酸塩の認識において、イオン相互作用とπ-π相互作用の同様の組み合わせが観察されたが、NNPファミリーは遠いものである26,29。 OFAファミリー10からのものであり、関与する残基の位置は互いに対応していません（図2b）。

シュウ酸結合および輸送に対する上記またはその隣接残基の重要性を調査した。 精製された OxlT は、特に基質の非存在下では不安定であるため、さまざまな機能アッセイを利用しました: (1) GFP サーマルシフト (GFP-TS) アッセイ 35宿主大腸菌細胞由来の脂質を含むOxlT-GFP融合タンパク質。 （２）ＯｘｌＴ３６を組換え発現する大腸菌細胞を用いた細胞内輸送アッセイ。 (3) 精製されたOxlTで再構成されたプロテオリポソームを使用したインビトロ輸送アッセイ。 GFP-TS アッセイでは、野生型 OxlT はシュウ酸結合時に熱安定性を示しました。 対照的に、シュウ酸依存性の熱安定化の程度は、変異体OxlTタンパク質Q34A、Y35A、Y124A、Y150A、N268A、R272A、W324AおよびK355Qでは減少した（図2c）。 変異体OxlTタンパク質の熱安定性は、シュウ酸塩の非存在下では野生型OxlTの熱安定性と大きく変わらなかったため（補足図5）、これらの結果は、残基での変異によりシュウ酸塩および/または結合構造の安定性が低下します。 セルロース内輸送アッセイでは、負の起電力性である大腸菌細胞内の OxlT によるシュウ酸 - ギ酸交換の程度を、共発現されたキセノルロドプシンによる光駆動の内向きプロトン移動と、その結果として生じる細胞の pH 上昇との共役によって評価した。外部溶液36（図2d）。 我々の以前の研究で活性の喪失が確認されていた非機能的変異体R272AおよびK355Q31,32に加えて、Q34A、Y35A、N268A、W324A、Y328AおよびW352Aを伴うOxlT変異も活性を低下させた（図2d）。 最後に、プロテオリポソームに再構成された精製OxlTを使用したインビトロ輸送アッセイが、R272Aおよび以前の研究でこの方法によってテストされていない変異体に対して実行されました（図2eおよび補足図6）。 2 つのシステムの違いによる若干の偏差にもかかわらず、プロテオリポソームアッセイとセルロアッセイの間で同様の傾向が観察されました。 興味深いことに、ほとんどの変異体は結合活性と輸送活性の両方の低下を示しましたが、Y124AおよびW324A変異は、シュウ酸結合能力が低下しているにもかかわらず、少なくとも輸送アッセイのいずれにおいても輸送活性に有意な影響を与えませんでした。 これらの観察は、親和性を低下させると、速度と親和性のトレードオフおよび/または基質流出の減少により、正味の取り込みが加速される可能性があるという事実によって説明される可能性があります 37。 対照的に、Y328AおよびW352Aは同様のシュウ酸結合を示したが、野生型OxlTと比較してシュウ酸取り込み活性が低下しており、触媒代謝回転におけるこれらの残基の重要性が示されている。 したがって、機能研​​究の結果は、OxlT 構造内の結合シュウ酸塩の近傍の残基がシュウ酸塩の結合および/または輸送において重要な役割を果たしていることを示唆しました。

基質と、吸蔵された OxlT 結晶構造内の残基との間の相互作用は、C2 ジカルボン酸シュウ酸塩に最適化されています。 シュウ酸分子は結合ポケットにしっかりと適合するため、シュウ酸をクレブス回路中間体などのより大きなジカルボン酸に置き換えると、OxlTの残基との立体衝突が生じ、閉塞された立体構造が不安定化する可能性があります（補足図7a）。 柔軟なドッキング研究の結果、閉塞したOxlTの結合部位にC3ジカルボン酸であるマロン酸を収容できる位置が得られたが、結合ポケット内のアミノ酸残基の再配置により、シュウ酸の場合に比べて相互作用が少なかった。 (補足図7b)。 これは、シュウ酸の 0.02 mM と比較して、マロン酸の Kd 値が 1.2 mM で、親和性と輸送活性が低下していることと一致しています 13。 柔軟なドッキングを行っても、C4ジカルボキシレートが閉塞したOxlTに結合する様子は観察されず、これらの分子がOxlT13による取り込みに関してシュウ酸と有意に競合しないことを示す以前の報告と一致した。 GFP-TS アッセイでは、OxlT に対するシュウ酸塩の最も高い特異性が確認されました。 OxlTの熱安定化はシュウ酸塩（C2）の存在下で顕著に観察されましたが、マロン酸塩（C3）またはコハク酸塩（C4）の存在下では観察されませんでした（補足図7c）。

シュウ酸結合部位から細胞質またはペリプラズムに至るまで、TM2 と TM11、TM5 と TM8、TM1 と TM7 のペリプラズムの半分、およびTM4 および TM10 の細胞質半分（図 2f–h）。 これらの相互作用により、閉塞構造内のドメイン間空洞の閉鎖が安定します。

シュウ酸結合部位の下の細胞質側では、Met128 (TM4)、Pro332 (TM10)、および Tyr348 (TM11) が関与する疎水性相互作用が観察され、続いて Asn129 (TM4) と Ser344 (TM11)、Arg133 (TM4) および Ser344 (TM4) の間の極性相互作用が観察されました。 Thr341 と Ala342 の主鎖カルボニル基 (TM11) (図 2f)。 これらの相互作用は、それぞれAsp78（TM2）またはAsp280（TM8）とTM11またはTM5のN末端との間に形成される細胞質末端の電荷双極子相互作用によってさらにサポートされています（図2g）。 2つのアスパラギン酸残基は、TM2-3（「G74YFVD78KFGP82R83IP」配列、AL2-3）またはTM8-9（G276FVSD280KIGR284YK、配列、AL8-9）領域の「A様」モチーフに位置しています（補足図3）。 モチーフ A は、MFS タンパク質で一般的に保存されているモチーフの 1 つであり、D(+5) はドメイン間の電荷ヘリックス双極子相互作用に関与することが知られています 38。 注目すべきことに、これらのアスパラギン酸残基は、細胞質側で広範なイオン相互作用ネットワークをさらに構成しています（図2g）。 具体的には、TM4 の Asp78 と Arg133、および TM1 の下流残基 Asp137 と Arg16 が塩橋を形成します。 さらに下流では、TM5 の N 末端にある Arg139 が、Asp337、Arg284、および Asp280 とともに電荷リレー ネットワークを形成します。

シュウ酸結合部位上のペリプラズム側では、TM1のThr38（側鎖）とTM7のVal240（主鎖）（2.72Å）の間の水素結合により、閉塞構造の細孔トンネルが閉じられます（図2h）。 水素結合の上では、Leu39 (TM1)、Leu52 (TM2)、Val244 および Pro245 (TM7)、および Val261 (TM8) が疎水性相互作用を形成します。

シュウ酸塩結合OxlTの閉塞された基質結合部位とは対照的に、リガンドフリーOxlTでは結合部位からペリプラズム空間までの大きな空洞が開いています（PDB ID 8HPJ;図1f）。 空の結合部位では、Lys355側鎖が電荷反発によりArg272から外れ、シュウ酸結合型で見られる位置から位置をシフトします（図3a）。 リガンドのない形態では、シュウ酸結合状態で観察されるドメイン間水素結合のほとんどが保持されます。 ただし、C 末端ドメインの Lys355 と N 末端ドメインの Gln34 の間の部分は、側鎖間の距離 (> ～ 4 Å) から判断すると、リガンドのない状態では破壊されている可能性があります。 Tyr35、Tyr150、Trp324、Tyr328などの周囲の芳香族残基の位置シフトも観察されました（図3b）。 シュウ酸塩の欠如による基質結合部位でのこれらの変化は、おそらく全体の構造の構造再配置の根底にあり、閉塞状態と外向き状態の間の構造変化をもたらします。 特に、ペリプラズムに開口する空洞は、広範囲の正に帯電した表面を示しました（図1fおよび3c）。 この基本特性は主に結合部位の Arg272 と Lys355 に由来します。 さらに、このキャビティの内側を覆う Lys45 および Arg248 の側鎖アミノ基と、Gln34、Asn42、Gln56、Asn264、Asn265、および Asn268 のアミド基が溶媒にさらされます。 これらのグループと、TM1、TM5、およびTM11の曲がったらせんの正の双極子モーメントも、キャビティ全体の基本特性に寄与します（図3c）。 空のリガンド結合部位および空洞の広範な基本表面でのArg272とLys355によって引き起こされる電荷​​反発は、シュウ酸塩の非存在下でポケットが閉塞形態に閉じるのを妨げ、したがって開いた状態を安定させる可能性があります。 基質の非存在下での開状態の立体構造の安定性は、閉塞状態への移行を防ぎ、対向輸送体としての OxlT 機能の基礎となっており、触媒プロセス中の基質の非存在下での立体構造のスイッチは許可されません 22,38。 同様の状況が硝酸塩/亜硝酸塩対向輸送体 NarK29 でも観察され、開いた空洞の正に帯電した表面が内向きの立体構造を安定化しました 26。

a 図 2a の同じ方向から見たリガンドフリー OxlT (PDB ID: 8HPJ) の結合部位の拡大図。 ドメインの色分けは図 1c のとおりです。 破線は潜在的な水素結合を示します。 b シュウ酸結合型およびリガンド非結合型の OxlT の基質結合部位構造の重ね合わせ。 c ペリプラズムに開いたキャビティの拡大図。 空洞に露出した極性残留物のモデルと、±5 kTe−1 の静電ポテンシャルマップで色付けされた表面も示されています。 パネル a ～ c​​ では、鎖 A として定義された分子が代表として示されています。

一方、リガンドを含まない OxlT 構造の細胞質部分は、シュウ酸結合構造の細胞質部分と大きな変化を示しません (図 1d)。

輸送サイクルに必要な立体配座スイッチを可能にする OxlT の構造動力学に対処するために、シュウ酸結合閉塞構造とリガンドのない外向き OxlT 結晶構造に基づいて分子動力学 (MD) シミュレーション 39 を実行しました。

まず、シュウ酸塩をタンパク質の外側に配置することで、リガンドのない外向き立体構造（PDB ID 8HPJ）へのシュウ酸塩の結合をシミュレートしました（図4a〜cおよび補足図8）。 Gln34、Tyr35、Arg272、Tyr328、およびLys355で、OxlTの結合部位に結合するシュウ酸イオンが観察された(図4b)。 シュウ酸イオンの幾何中心と結合部位残基の間の距離（カットオフ距離5Å）によって結合が決定されました（図4c）。 シュウ酸イオンと Lys355 の相互作用により、リガンドのない形態の Arg272 との電荷反発が解消され、側鎖の配置が反転した状態から復元されました。 負に帯電したシュウ酸イオンの急速な結合は、広範囲の正に帯電した表面によって促進されます（図1fおよび3c）。 結合立体構造の安定性は、Lys355 のプロトン化状態 (pKa の計算方法を参照) に依存し、これは領域によって 5 から 8 まで変化する腸内の pH 40 と結合部位の疎水性環境 41 の影響を受ける可能性があります。 。 プロトン化されたLys355の場合、単一の結合イベントが観察され、結合シュウ酸イオンはシミュレーションの残りの間、ほとんどが結合部位に残りました（図4cの上のパネルの灰色の線）。 対照的に、中性の Lys355 では、さまざまなシュウ酸イオンの複数の結合および結合解除イベントが観察されました (図 4c の下のパネルの色付きの線)。 これにより、プロトン化 Lys355 の占有率は 98.6% となり、中性 Lys355 の占有率は 77.0% よりも高くなります。これは、シュウ酸塩と結合部位の距離を使用した結合状態の上記の定義によって計算されます。 したがって、プロトン化された Lys355 では、より低いシュウ酸解離定数が予測されます。 1.7μsのシミュレーション中、外向きの結晶構造からの主鎖原子のRMSDのプロットに示されているように、OxlTの外向きの立体配座は安定していました（図4a）。 この結果は、シミュレーションで観察されたシュウ酸塩の結合は初期段階の結合モードであり、その後に結合部位の構造再配列と脱溶媒和が行われ、完全に結合した構造に適応させるために閉塞構造への移行が続く必要があることを示唆しています。

a〜c MD シミュレーションは、配位子のない外向き OxlT 結晶構造 (PDB ID 8HPJ) から開始しました。 a 初期の外向き結晶構造からの RMSD は、Lys355 の異なるプロトン化状態を持つ 2 つの軌跡について異なる色で示されています。 b プロトン化 Lys355 を含む OxlT に結合したシュウ酸塩のスナップショット。 ズームアウトしたスナップショットでは、シュウ酸イオンから 15 Å 以内の距離にある水分子が CPK 色で表示され、15 ～ 25 Å の距離にある水分子は青色で表示されます。 拡大スナップショットでは、シュウ酸イオンから 15 Å 以内の距離にある水分子が示されています。 c プロトン化 Lys355 (上) または脱プロトン化 Lys355 (下) のいずれかを使用した、単一軌道における結合部位からシュウ酸イオンの距離が示されています。 シュウ酸イオンと結合部位残基の幾何学的中心を使用して距離を計算しました。 異なる色は、シミュレーションに含まれる異なるシュウ酸イオンを表します。 d-f MD シミュレーションは、シュウ酸結合閉塞 OxlT 結晶構造 (PDB ID 8HPK) から開始されました。 d 初期の吸蔵結晶構造からの RMSD が 3 つの独立した軌跡について異なる色で示されています。 e OxlT の疎水性ゲート。 上のパネルでは、結合したシュウ酸イオンから 15、8、4 Å の距離内にある水分子の数がそれぞれ茶色、黄色、赤色でプロットされています。 下のパネルでは、1000 ns でのスナップショットがズームアウト ビューとクローズアップ ビューで表示されます。 水分子はパネルbと同じように着色されています。 補足ムービー 1 も参照してください。 f Gln34 反転によって引き起こされる、閉塞構造から外向き構造への観察された遷移。 シュウ酸イオンおよび結合部位残基は棒グラフで示されています。 Gln34 は赤い丸で強調表示されます。 水の分子は vdW 表現で示されます。 水分子はパネルbと同じように着色されています。 Thr38 側鎖と Val240 主鎖の間の黒と赤の破線は、それぞれ H 結合の内側または外側の距離を示しています。 補足ムービー 2 も参照してください。

次に、シュウ酸結合状態における閉塞構造 (PDB ID 8HPK) の構造ダイナミクスに取り組みました。 1 μs のシミュレーション中、3 つの独立した軌道のうち 2 つは閉塞状態のままでした (図 4d)。 閉塞構造では、シミュレーション中にほとんどの水分子がトランスポーターのペリプラズム側と細胞質側の特定の位置でブロックされましたが、一部はOxlTに入りました（図4eおよび補足ムービー1）。 水密度分析により、シミュレーション中にシュウ酸結合部位への水の侵入をブロックする構造層が特定されました（補足図9）。 これらの1つは、ペリプラズム側のTM1のThr38とLeu39、TM7のVal244、およびTM8のVal261からなる疎水性層です（図4eの左下のパネル）。 この層は、TM7のThr38とVal240の間の水素結合（図4eの左下のパネルに破線で示されています）と組み合わされて、細胞外側へのリガンドの出口もブロックし、したがってペリプラズムゲートとして機能しました。 他の層は、細胞質側にあるTM4のMet128、TM10のPro332、およびTM11のTyr348で構成されています（図4eの右下のパネル）。 これらのペリプラズムおよび細胞質の疎水性ゲートは、TM1-TM7水素結合とともに、整列構造のOxlTと同様の位置にある残基に基づいて、以前に報告されたNarKトランスポーター42と類似性を持っています（補足図10）。 この結果は、疎水性ゲート 39 が 2 つのトランスポーター間で保存されたメカニズムであることを示唆しています。

対照的に、閉塞構造からの 1 つの軌道では、ペリプラズム ゲートの開口が観察されました (図 4d の青線)。 移行では、結合部位からの Gln34 側鎖の反転が最初に発生しました (図 4f、補足図 11a、および補足ムービー 2)。 Gln34 の反転により、外向きの結晶構造で観察されるように、Lys355 との水素結合が破壊されました (図 3a)。 さらに、TM1ではGln34がThr38の1ターン上流に位置しているため、反転によりThr38とVal240の間の水素結合が継続的に破壊され、反転前から熱揺らぎによって結合したり切断されたりした（破線で示す）。図4fおよび補足図11b）。 Gln34の反転から約280ns後、OxlTは外側に開き始め、多くの水分子がトランスポーターに入りました（図4fおよび補足ムービー2）。 Gln34のフリップは一時的な構造であり、シミュレーションの最後の部分で外向きの状態に達した後、側鎖が元の位置に戻ったことに注目します。これは、外向きの結晶構造の観察と一致しています（補足図1）。 11a、c)。 注目すべきことに、Gln34フリップは、結合部位でモデル化されたギ酸による閉塞立体配座から始まる軌跡でも観察されました（補足図12）。 この軌道では、Thr38とVal240の間の水素結合はGln34の反転後に再び完全に切断され、続いてO. formigenesのペリプラズムへのギ酸放出の生理学的反応に従って、閉塞構造から外向き構造への移行が起こった。 。 対照的に、Gln34フリップは、シュウ酸結合型およびギ酸結合型の両方での立体構造遷移を伴わない他の軌道では観察されませんでした（補足図11および12）。 これらの発見は、Gln34側鎖がThr38とVal240の間の水素結合と連携して、閉塞構造から外向き構造への移行を防ぐ「ペリプラズムゲートのラッチ」として機能していることを示唆している。 実際、Q34A変異体は野生型タンパク質と比較して結合活性と輸送活性の部分的な喪失を示し（図2c〜e）、この変異が閉塞構造を不安定化させることを示しています。 Gln34は、Thr38とともに、OFAファミリー内で厳密に保存されています（補足図3）。

閉塞された結合部位のシュウ酸イオンのOCCO二面角は、Gln34フリップ後〜90°になりました（補足図13a）。これは、溶液で観察された値です43。 これは、Gln34フリップのない他の2つの軌跡とは対照的であり、シュウ酸二面角は約40〜50°（および130〜140°の反転位置;補足図13a）のままであり、結晶構造で見られるものと類似しています。 QM/MM の計算。 興味深いことに、シミュレーション中に外側に面したOxlTへの結合シュウ酸塩で観察された値は、~60°と~120°に二重ピークを持って広く分布していました(補足図13b)。これは溶液中の値とは異なり、むしろ溶液中の値に近いものです。閉塞された結晶構造で。 これらの発見は、結合したシュウ酸塩が、OxlT 構造スイッチングによって引き起こされる環境変化に応じてその構造を再配置し、トランスポーターサイクルの次のステップに有利な構造を採用することを示唆しています。

閉塞構造からのどの軌道についても、1 μs シミュレーション中に細胞質ゲートの開口は観察されませんでした。 これは、外向き構造を安定化することが知られている電荷リレーネットワークを含むモチーフA（図2g）など、細胞質側で観察される広範なドメイン間相互作用に起因する可能性があります38。 これらの結果は、閉塞状態から内向きに開いた状態への移行が輸送プロセス全体の中で遅い速度であることを示唆しています。 シュウ酸結合の減少を示すが、輸送活性は保持している謎の変異体の1つであるY124A（図2c〜e）は、結合したシュウ酸の下の細胞質ゲートの入り口に位置しています（図2fおよび4f）。 この変異はゲートの疎水性層を不安定化し、おそらく輸送の律速段階であるその開口を促進し、輸送活性におけるシュウ酸に対する親和性の低下を補う可能性がある。

OxlT の 2 つの結晶構造とそれらに基づく MD シミュレーションは、OxlT の交互アクセス輸送プロセスを理解する手がかりを提供しました (図 5)。 以下のプロセスは、腸内の O. formigenes で形成される電気化学的勾配に従って説明されます。 シュウ酸塩の取り込みプロセスでは、OxlT はペリプラズムに開いた空洞内に広範な正に帯電した表面を示し、結合部位への酸性シュウ酸塩の結合を可能にします。 正に帯電した表面は、対向輸送体にとって不可欠な特性である基質の不在下での次の輸送ステップへの構造転移も回避します。 それにもかかわらず、シュウ酸結合は局所的な正電荷を中和し、外向き構造から閉塞構造への構造切り替えを可能にします。 さらに、OxlTに対するシュウ酸塩の相対的な結合自由エネルギーを計算すると、外側に開いた立体構造と比較して、閉塞立体構造における顕著な安定化（つまり、約20kcal/molの減少）が明らかになり、これはシュウ酸塩によって誘発される立体構造スイッチの物理的根拠を提供する。バインディング (「方法」セクションおよび補足表 4 を参照)。 閉塞状態は、結合ポケットによって課せられるサイズ制限を利用して、シュウ酸塩とクレブス回路などの必要な宿主代謝中間体との間の識別チェックポイントとして機能する輸送にとって不可欠なステップである。 閉塞された立体構造により、最終的には細胞質ゲートが開き、シュウ酸塩が細胞質に放出される可能性があります。

ペリプラズムおよび細胞質のゲート距離に沿った OxlT の立体構造の様子を右上のパネルに示します。 閉塞状態と外向き開放状態、および Gln34 誘発遷移の MD シミュレーションにおけるゲート残基の Cα 距離は、それぞれ赤、黄色、青で示されています。 現在の閉塞結晶構造 (PDB ID 8HPK) および外向き結晶構造 (PDB ID 8HPJ)、および Nark 内向き結晶構造 (PDB ID 4U4T) のゲート-残留物距離も示されています。

その後、内向きのOxlTに結合したギ酸塩がトランスポーターを閉塞状態に戻す可能性があります。 アンチポートサイクルにおいて閉塞状態から初期の外向き状態に戻るために必要な立体構造遷移は、基質に隣接する残基 Gln34 の側鎖の一時的な反転と、Thr38 と Val240 の間の水素結合の破壊によって達成できます。 。 MD シミュレーションでサンプリングされたペリプラズム ゲート (Thr38 – Val240) と細胞質ゲート (Met128 – Pro332) の距離 42,44 によってプロットされた立体構造ランドスケープは、秩序パラメーターが閉塞立体構造と外向き立体構造を適切に分離していることを示しています (図の赤と黄色のプロット)。 .5差し込み）。 それにもかかわらず、Gln34 フリップを伴う唯一の軌跡は、終点の閉塞された外向きの結晶構造をカバーする完全な遷移を示しています (図 5 挿入図の青い点)。 単一の側鎖反転によって引き起こされる構造変化のメカニズムと、高いグリシン比によって促進される構造の柔軟性が、OxlT12 が示す急速な触媒代謝回転の原因となる可能性があります。

これらの構造観察は、OxlT が MFS 構造を利用し、宿主動物と腸内微生物との間の好ましい共生に従って進化したことを示唆しています。 OxlT の構造的および機能的特徴も、他の OFA ファミリー メンバーの構造的および機能的特徴の基礎となっている可能性があります。 約 2,000 の OFA メンバーがデータベースに登録されています 45 が、OxlT を除くすべてのメンバーは機能的に特徴付けられていません。 したがって、この研究は未知の「ダーク」タンパク質ファミリーの理解にも貢献します。 OxlT の内向き立体構造 (図 5 挿入図の点線の円) を明らかにすることは、OxlT の構造生物学を理解する次の課題です。

すべての動物実験は、日本の実験動物の管理と使用に関するガイドラインに準拠し、東京大学動物実験委員会によって承認されました（許可番号：RAC07101）。

O. formigenes 株 OxB46 由来の C 末端 nona-His タグ付き OxlT を、1 mM イソプロピル-β-d-チオガラクトピラノシド (IPTG) を用いて大腸菌 XL3 で 20 °C で 24 時間発現させました47。 細菌細胞を溶解バッファー (50 mM Tris-HCl、200 mM 酢酸カリウム、1 mM EDTA、1 mM PMSF、5 mM MgCl2、20 μg/mL DNaseI、および 0.23 mg/mL リゾチーム、pH 8.0) に懸濁し、次に使用して破砕しました。 EmulsiFlex C-5 (アベスティン)。 細胞破片を遠心分離（9,600×gで30分間）によって除去し、次いで細胞膜を遠心分離（185,000×gで1時間）によって収集した。 膜画分をバッファー A (20 mM HEPES-KOH、200 mM 酢酸カリウム、10 mM シュウ酸カリウムおよび 20% グリセロール、pH 8.0) 中の 40 mM n-ドデクリ-β-d-マルトシド (DDM) で可溶化し、 XK16 カラム (GE Healthcare) 内の Ni-NTA Superflow 樹脂 (QIAGEN) または HisTrap FF 粗生成物 (GE Healthcare)。 カラムを 1 mM DDM および 30 ～ 50 mM イミダゾールを含むバッファー A で洗浄し、次にタンパク質を 1 mM DDM および 250 mM イミダゾールを含むバッファー A で溶出しました。

プロテオリポソーム抗原は、免疫応答を促進するために、精製された機能性 OxlT を、卵ホスファチジルコリン (PC) (Avanti Polar Lipids) とアジュバント リピド A (Sigma) の 10:1 混合物からなるリン脂質小胞に高密度で再構成することによって調製されました。 BALB/c マウス (7 週齢の雌) を、2 週間間隔で 3 回注射してプロテオリポソーム抗原で免疫化しました。 マウスは、周囲温度 23 ± 3 °C、湿度 40 ～ 60%、12 時間の明暗サイクルの条件下で保管されました。

OxlT に対するマウスモノクローナル抗体は、以前に記載されているように選択されました 48。 抗体産生ハイブリドーマ細胞株は、従来の融合プロトコルを使用して生成されました。 OxlT の立体構造エピトープを認識する抗体を産生するハイブリドーマクローンは、精製 OxlT を含む固定化リン脂質小胞に対するリポソーム酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) によって選択され、OxlT のネイティブ立体構造を認識する抗体のポジティブ セレクションが可能になりました。 SDS 変性 OxlT への抗体結合の減少に関する追加のスクリーニングを、線状エピトープ認識抗体に対するネガティブ選択に使用しました。 OxlT と各抗体クローン間の安定した複合体形成を、蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィーで確認しました。 モノクローナル ハイブリドーマの大規模培養上清から収集され、プロテイン G アフィニティー クロマトグラフィーを使用して精製された IgG 分子全体をパパインで消化し、HiLoad 16/600 Superdex200 ゲル濾過に続いてプロテイン A アフィニティー クロマトグラフィーを使用して Fab フラグメントを単離しました。 Fab の配列は、ハイブリドーマ細胞から単離された全 RNA を使用した標準的な 5'-RACE によって決定されました。

OxlT に対する一本鎖 Fv (scFv) フラグメントは、免疫化マウスファージディスプレイ抗体ライブラリーからスクリーニングされました 49。 免疫化したマウスを安楽死させ、その脾細胞 RNA を単離し、逆転写 PCR によって cDNA に変換しました。 VL および VH レパートリーは 18 アミノ酸の柔軟なリンカーを介して組み立てられ、ファージ ディスプレイ ベクター pComb3XSS にクローニングされました。 ビオチン化プロテオリポソームは、卵 PC と 1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップ ビオチニル) (16:0 ビオチニル キャップ-PE; Avanti) の混合物で OxlT を再構成することによって調製され、結合として使用されました。 scFv ファージ選択のターゲット。 標的は、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズ (Dynabeads) またはストレプトアビジンでコーティングされたマイクロプレート (Nunc) 上に固定化されました。 4 ラウンドのバイオパニングの後、個々のコロニーのペリプラズム抽出物に対してリポソーム ELISA を実行しました。 陽性クローンを収集し、Biacore T100 (GE Healthcare) を使用して評価しました。

抗体 scFv フラグメントは、分子間でドメイン交換二量体を形成する可能性があり、二量体と単量体の平衡により構造的不均一性が増大する可能性があるため、結晶化シャペロンとして使用するのは望ましくありません。 したがって、結晶化試験には Fv フラグメントを使用しました。 Fv フラグメントは、iRAT システム 50 を使用して Brevibacillus choshinensis で発現されました。 培養上清を６０％硫酸アンモニウム飽和に調整し、沈殿をペレット化し、ＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ トリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭおよびＮａＣｌ）に溶解し、同じ緩衝液に対して一晩透析した。 透析したタンパク質を、緩衝液B (10 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaClおよび20 mM イミダゾール)で平衡化したNi-NTA樹脂と混合した。 結合タンパク質を緩衝液C (10 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaClおよび250 mM イミダゾール)で溶出し、TEV-His6と混合し、TBS緩衝液に対して一晩透析した。 切断された His6 タグと TEV-His6 を、バッファー B で平衡化した HisTrap カラムを使用して除去しました。タグを含まない Fv フラグメントを濃縮し、TBS バッファーで平衡化した HiLoad16/60 Superdex75 カラム (GE Healthcare) にロードしました。 ピーク画分をプールし、濃縮し、液体窒素中で急速冷凍し、-80 °C で保存しました。

D5901Fab と複合体を形成したシュウ酸結合 OxlT を結晶化するために、精製した OxlT を精製 D5901Fab と 1:1.3 のモル比で 4 °C で一晩混合し、緩衝液 D を使用して HiLoad 16/60 Superdex200 pg カラム (GE ヘルスケア) にアプライしました ( 20 mM MES-KOH、200 mM 酢酸カリウム、10 mM シュウ酸カリウム、20% グリセロール、および 0.51 mM DDM、pH 6.2) をランニングバッファーとして使用します。 精製サンプルを緩衝液E (20 mM MES-KOH、10 mM シュウ酸カリウムおよび0.51 mM DDM、pH 6.2)中で透析した。 結晶は、精製サンプル (約 10 mg/mL) を 0.1 M クエン酸ナトリウム、pH 5.5、0.05 M NaCl および 26% (v/v) のリザーバー溶液と混合することにより、20 °C でシッティング ドロップ蒸気拡散法によって得られました。 PEG400。 データ収集の前に、結晶を液体窒素中で凍結させました。

20D033Fvと複合体を形成したリガンドフリーOxlTの結晶化のために、精製OxlTを精製20D033Fvと1:2のモル比で4℃で一晩混合し、緩衝液F（20 mM MES）中でSuperdex200 Increase 10/300 GL（GEhealthcare）を使用して精製しました。 -KOH、100 mM 酢酸カリウム、10 mM シュウ酸カリウムおよび 0.02% DDM、pH 6.2)。 精製されたサンプルは脂質中間相に再構成されました。 タンパク質−ＬＣＰ混合物は、５０％（ｗ／ｗ）タンパク質溶液、４５％（ｗ／ｗ）モノオレイン（Ｓｉｇｍａ）および５％（ｗ／ｗ）コレステロール（Ｓｉｇｍａ）を含んでいた。 得られた脂質中間相を96ウェルガラスプレートに50μL滴として分注し、NT8-LCP結晶化ロボット(Formulatrix)を使用して0.8μLの沈殿剤溶液を重層し、次いで薄いカバーガラスで覆った。 結晶化セットアップと 96 ウェルガラスサンドイッチプレート (Molecular Dimension) を 20 °C でインキュベートしました。 結晶は、以下の沈殿条件下で 1 週間で得られました: 100 mM グリシン、pH 9.0、26 ～ 36% (v/v) PEG400、および 50 ～ 150 mM MnCl2。 Mesh Litholoops (Protein Wave) を使用して脂質中間相から結晶を直接採取し、液体窒素で瞬間冷却しました。

シュウ酸塩結合 OxlT およびリガンドフリー OxlT の X 線回折データは、SPring-8 ビームライン BL41XU で MX225HE (Raynoix) を使用し、BL32XU では EIGER X 9 M 検出器 (Dectris, Ltd) を使用してそれぞれ 1.0 Å で収集されました。 BSS51 と 100 K で動作するクライオストリームの制御下でデータを結合、統合し、BLEND53、XDS54、および XSCALE55 を利用する KAMO システム 52 を使用して 2.6 Å (シュウ酸塩結合 OxlT) と 3.1 Å (リガンドフリー OxlT) にスケーリングしました。 (補足表 1)。 データは、STARANISO サーバーを使用して異方性について補正されました56。 この修正により、高解像度のシェルで球面の完全性が非常に低い多くの弱い反射が削除されました。 改良のために、それぞれ 25% (シュウ酸結合 OxlT) と 22% (リガンドフリー OxlT) 以上の最上位シェル内のデータ。 結晶構造は、PHASER57 による分子置換を使用して解析されました。 検索モデルは、グリセロール-3-リン酸トランスポーター GlpT (PDB ID: 1PW4)58 およびシュウ酸結合 OxlT の Fab フラグメント (PDB ID: 1XF4)59 の N および C 末端半分の構造、および N の構造でした。 - この研究で決定されたシュウ酸結合 OxlT の C 末端半分 (それぞれ残基 11 ～ 199 および 204 ～ 404)、およびリガンドを含まない OxlT の scFv フラグメント (PDB ID: 5B3N)60。 構造モデルは COOT61 で手動で再構築され、Phenix62 で洗練されました。 リガンドを含まない OxlT 結晶では、非対称ユニット内に 2 つの OxlT ユニット (鎖 A および D) が見つかりました。 2 つの間に有意な構造上の違いは観察されませんでした (残基 15 ～ 410 の Cα RMSD は 0.365 Å)。 データ収集と精製統計を補足表 1 および補足表 2 に示します。 MolProbity63 で分析したラマンチャンドラン統計は、シュウ酸結合 OxlT については 97.8% が有利、2.2% が許容値、0.0% が外れ値であり、シュウ酸結合 OxlT については 97.5% が有利、2.5% が許容、0.0% が外れ値でした。リガンドフリーのOxlT。

OxlT のリガンド結合は、GFP サーマル シフト アッセイ (GFP-TS) を使用して評価されました 35。 C 末端 GFPuv 融合 OxlT の発現ベクターは以前に構築され 23、PrimeSTARMax (タカラバイオ) と補足データ 1 にリストされているオリゴヌクレオチドプライマーを使用した PCR によってベクターに変異が導入されました。タンパク質は BL21(DE3) で発現されました。基本的には「OxlT の調製」のサブセクションに記載されているとおりであり、タンパク質生産は OD600 0.8 ～ 0.9 で開始され、20 °C で 20 時間誘導されました。

C末端GFPuv融合OxlTを発現する菌体を緩衝液G（20mM HEPES-KOH、300mM酢酸カリウム、pH7.0）に懸濁し、UD201（TOMY）を用いて超音波処理により破砕した。 膜画分を得るために、細胞破片を遠心分離（17,800×g、4℃で15分間）によって除去し、次いで上清を252,000×gで30分間、4℃で遠心分離した。 緩衝液Gによる懸濁を繰り返し、続いて252,000×g、4℃で30分間超遠心分離することによって膜画分を2回洗浄した。 20 mL 培養物からの膜画分を、1% (w/v) DDM を含む 240 または 480 μL の緩衝液 G で可溶化しました。 4℃で1時間可溶化した後、4℃で20分間161,000×gの超遠心分離により不溶性物質を除去した。

変異体アッセイでは、界面活性剤で可溶化した野生型および変異体 OxlT-GFPuv タンパク質を 1% DDM を含む緩衝液 G で希釈して、同じ蛍光強度が得られる OxlT-GFPuv 濃度を調整しました。 次いで、溶液を、３ｍＭシュウ酸カリウムの存在下または非存在下で、氷上で１時間インキュベートした。 リガンドアッセイでは、野生型 OxlT-GFPuv 溶液を 10 mM シュウ酸ナト​​リウム、マロン酸ナトリウム、またはコハク酸ナトリウムの存在下または非存在下でインキュベートしました。 インキュベーション後、緩衝液 G 中のオクチル-β-d-グルコシドを最終濃度 1% になるように添加し、C-1000 Touch Thermal Cycle (BIO) を使用して溶液を 30 ～ 80 °C で 10 分間熱変性させました。 -RAD）。 次に、溶液を 10,740 ～ 15,340 × g (ローター内のチューブの位置に応じて TOMY PCR96-02 ローターを使用して 14,000 rpm) で 4 °C で 20 分間遠心分離することにより、凝集画分を除去しました。 得られた上清を384ウェルLow Volume Black Microplate (Corning)に分注し、Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific)を使用して励起波長395 nmおよび発光波長507 nmで蛍光強度を測定した。 観察された蛍光強度を緩衝液のバックグラウンドの蛍光強度で差し引き、熱変性なしのサンプルの値を 1、バックグラウンドを 0 として正規化しました。 見かけの融解温度 (Tm) 値は、蛍光強度値を次の値に当てはめることによって推定されました。 Kaleidagraph (Hulinks) を使用した Gibbs-Helmholtz 方程式 64 では、目的のタンパク質がフォールディング状態とアンフォールディング状態の間で平衡状態にあると仮定し、アンフォールディングのエンタルピーと熱容量の変化 (ΔH、ΔCp) および Tm を独立変数として設定します。 データは、Prism 8 (GraphPad) で野生型 (WT) を参照として使用し、ダネット検定による両側一元配置分散分析によって分析されました。 統計的有意性は *P < 0.05 として定義されます。

OxlT の輸送活性は、組換え大腸菌細胞を用いた in cellulo システムと、精製された OxlT で再構成されたプロテオリポソームを用いた in vitro システムの両方を使用して評価されました。 変異体 OxlT アッセイの場合、PrimeSTARMax と補足データ 1 にリストされているオリゴヌクレオチド プライマーを使用した PCR によって、OxlT 発現ベクター pRSF-OxlT36 に変異が導入されました。

in cellulo アッセイでは、OxlT 活性は、以前に記載されているように、大腸菌で共発現されたゼノルロドプシンによる光駆動の内向きプロトン移動とカップリングすることによって測定されました 36。 簡単に説明すると、OxlT およびキセノルロドプシンの発現ベクターで形質転換された大腸菌 BL21 (DE3) 細胞を 37 °C で培養し、1 mM IPTG および 10 μM オールトランス レチナール (Sigma) を一定温度で添加することによってタンパク質生産を誘導しました。 600 nm での吸光度は 0.8 ～ 0.9。 20°Cで20時間培養した後、大腸菌細胞を遠心分離によって収集し、660 nmでのODが約10の細胞密度になるまで50 mM K2SO4で懸濁しました。 細胞懸濁液の光誘発 pH 変化は、25 °C で継続的に撹拌しながら pH 電極で監視しました。 まず、サンプルの pH が安定するまで、細胞懸濁液を暗所に置きました。 次に、シャープカットフィルター Y44 (420 nm 以上のロングパスフィルター、HOYA) を通して Xe ランプを使用してサンプルを 10 分間照射し、シュウ酸塩の非存在下での pH 変化 (ΔpH0) をモニターしました。 光強度は、光パワーメーターと光センサーを使用して、550 nm で約 150 mW/cm2 に調整されました。 照射されたサンプルを暗所に戻し、pH が安定したら、5 mM シュウ酸カリウムをサンプルに添加して、OxlT による 10 分間の輸送を可能にしました。 サンプルを上記と同じ条件で再度照明し、pH 変化 (ΔpHS) を監視しました。 輸送活性は、ΔpHSとΔpH0の間のpH変化の差（ΔΔpH）によって評価されました。 これは、キセノルロドプシンのみを発現する大腸菌で測定されたバックグラウンドの差分pH変化(ΔΔpH)を差し引くことによってさらに補正された。 各変異体の活性は、補正されたΔΔpH と、Penta・His 抗体 (QIAGEN、カタログ番号 34460、1:2000 希釈) を使用したウェスタンブロッティングによって分析された、野生型 OxlT の相対発現レベルによって正規化されました。実験と同じ日（補足図14;切り取られていないブロットはソースデータファイルにあります）。 また、Y150A 変異体のアッセイも実施しました。 ただし、この変異体は未知の理由によりゼノルロドプシンの発現レベルに影響を与えたため（補足図14）、したがってこの論文からY150Aの結果を除外しました。

インビトロアッセイでは、上記および「OxlTの調製」サブセクションに記載したように若干の変更を加えて、WTおよび変異体OxlTタンパク質を発現および精製した。 OxlT タンパク質を、溶出バッファーにグリセロールが存在しない状態で Ni-NTA 樹脂から溶出し、20 mM MES-KOH、200 mM 酢酸カリウムで平衡化したサイズ排除クロマトグラフィー カラム Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) で精製しました。 、０．２ｍＭ ＤＤＭ、ｐＨ６．２。 単量体画分をプールし、約 1 mg/ml まで濃縮し、20% (v/v) グリセロールを補充し、定量し、等分し、さらに使用するために急速冷凍しました。 プロテオリポソームは、Lee et al.65 に記載されているものと同様に調製されました。 大腸菌総脂質抽出物（Avanti、クロロホルム中）をガラス管に等分し、窒素ガス流下、室温で5分以上かけて溶媒を蒸発させた。 単層小胞を得るために、乾燥大腸菌脂質を 50 mM MOPS-KOH および 10 mM ギ酸カリウムを含む溶液 (pH 7.0) に 6.7 mg/ml で再懸濁し、水浴超音波処理器で 45 秒間超音波処理しました。 単層小胞は、脂質:タンパク質比 200:1 (w/w) の精製 OxlT バリアント、または等量の対照バッファー (OxlT 溶液と同じ体積の 1.57 mM DDM を含む 50 mM MOPS-KOH) で再構成されました。 ) 液体窒素とウォーターバスを使用した 3 回の凍結融解サイクルにより、マイクロチューブ内で培養します。 再構成された単層小胞を、氷上でハンドプローブ装置を使用して合計 15 秒間 3 回超音波処理して、直径 <200 nm の (プロテオ) リポソームを形成しました。

シュウ酸塩取り込みアッセイは、20℃でリポソーム溶液に50mMシュウ酸カリウムを添加することによって開始した。 実験を開始する前に、AG1-X8 陰イオン交換樹脂 (BioRad) を 1:1 (w/v) 容量の 150 mM 酢酸ナトリウム、pH 8.2 で平衡化し、400 μL のスラリーを 700 で 1 分間遠心分離することによって調製しました。スピンカラム上で×g、4 °C。 合計で、50 μL の反応液を直ちに、または図に示す時間のインキュベーション後に収集しました。 反応液をAG1-X8スピンカラムにアプライし、700×g、4℃で1分間遠心分離することによりリポソーム外のシュウ酸イオンを除去し、サンプルをマイクロチューブに回収した。 続いて、５μＬの１０％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（ナカライテスク）溶液を各サンプルに添加して、リポソーム内に輸送または付着したシュウ酸イオンを含むリポソームを溶解した。 相対シュウ酸濃度は、組換えOxOx (B. subtilis、Biovision) を使用した酸化反応と組み合わせたシュウ酸オキシダーゼ (OxOx) アッセイキット (Abcam) を利用して測定しました。 低容量 384 ウェル プレートの各ウェルで、10 μL のリポソーム ライセートを 10 μL の検出バッファー (9 μL OxOx アッセイ バッファー、0.4 μL OxOx コンバーター、0.2 μL レッド プローブ、0.02 μg OxOx、水で最大 10 μL) と混合しました。 （Corning）マルチチャンネルピペットを使用して。 プレートは、535 nm (帯域幅 12 nm) で励起、587 nm で発光、積分時間 200 ミリ秒、室温で合計 83 分間、20 秒間隔の蛍光反応速度論モードで Varioskan Flash によって直ちに読み取られました。 蛍光 - 時間曲線の初期傾きは、最初の 600 秒データの線形回帰によって決定され、OxOx 反応の初速度として解釈されました。これは、このアッセイ条件下でシュウ酸濃度と線形相関していました（補足図 6）。 。 少なくとも 2 つの独立したリポソーム調製およびシュウ酸輸送アッセイを OxlT 変異体および陰性対照に対して実施し、OxOx アッセイを各条件について 2 回または 4 回実施しました。 最後の棒グラフは、60 分の WT データの平均に対する正規化された値を表示します。

データ (インビトロアッセイの場合は 60 分時点) は、WT を参照として使用し、Prism 8 のダネット検定による両側一元配置分散分析によって分析されました。 統計的有意性は *P < 0.05 として定義されます。

OxlT 結晶構造を初期構造として使用し、MODELLER66 でモデル化された中央ループの残基が欠落しています。 プロトン化状態は、PROPKA 3.167,68 をデフォルトのパラメーターで使用して分析されました。 分析に基づくと、Lys355 は外側に面した構造で 7.00 の逸脱した pKa 値を示します。 この偏差は、閉塞構造（pKa 値 8.61）では観察されませんでした。 したがって、Lys355 の両方のプロトン化状態は外向きの状態であると考えられました。 OxlT タンパク質は、CHARMM-GUI の Membrane Builder プラグインを使用して膜に埋め込まれました 69,70。 x および y 次元の長さが 120 Å の 1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルエタノールアミン (POPE) 二重層を使用しました。 PE 脂質は、OxlT が由来する O. formigenes 71 と輸送アッセイが行われた E. coli 72 の両方の主要成分です。 さらに、他の特定の脂質が OxlT 活性に必要であるという証拠はありません。 タンパク質 - 膜系は TIP3P 水分子と 150 mM KCl で溶媒和​​され、z 次元の長さは 100 Å になりました。 次に、AmberTools1773 を使用して、溶液中のシュウ酸塩モデルのスケーリングされた有効電荷 (-1.5e) を考慮して、総電荷を変更することなく、87 個の Cl- をすべて 58 個のシュウ酸イオンに置き換えました (下記の ECCR を参照)。 最終的な MD システムには、閉塞された OxlT システムと外向きの OxlT システムにそれぞれ 146015 個と 143611 個の原子が含まれていました。 次に、NAMD 2.1274 を使用して MD シミュレーションを実行しました。 Amber ff14SB および Lipid14 力場は、それぞれタンパク質と膜を記述するために使用されました 75,76。 溶液中のシュウ酸リガンドは、Kroutil らによって開発された Ab Initio Molecular Dynamic シミュレーションに基づく、再スケーリングによる電子連続体補正 (ECCR) によって決定されたパラメーターを使用して記述されました 43,77。 OxlT の結合部位のシュウ酸リガンドは、タンパク質環境が水溶液の環境とは異なることを考慮して、ECCR 補正を適用せずに、拘束静電電位 (RESP) スキーム 78 によって決定されたパラメーターを使用して記述されました。 RESP 料金は、Antechamber ソフトウェアによって計算されています79。 私たちの知る限り、シュウ酸塩とタンパク質の複合体をシミュレートした研究はまだありませんが、いくつかの MD 研究ではバルクでのシュウ酸アニオンの溶媒和、カルシウムカチオンとの複合体形成、および吸着表面プロセスがシミュレートされています 80,81,82。 MD システムは 10,000 ステップの最小化でセットアップされ、NVT アンサンブルで 1 度あたり 0.1 ns のステップで 0 ～ 10 K まで加熱され、次に NPT で 30 度あたり 0.2 ns のステップで 10 ～ 310 K まで加熱され、10次に、NPT 条件での 1.0 μs と 1.7 μs の生産実行を、閉塞 OxlT 系と外向き OxlT (Lys355 の各プロトン化状態ごと) 系に対してそれぞれ実行しました。 ノーゼ・フーバー・ランジュバンピストンを使用して圧力を1気圧に設定し、ランジュバンサーモスタットで温度を310Kに維持しました。 周期境界条件を適用し、実空間カットオフ 12 Å およびスイッチ関数 10 Å を使用した粒子メッシュ Ewald 法によって長距離静電相互作用を処理しました。 積分時間ステップは 2 fs でした。

ギ酸塩を用いたシミュレーション システムを確立するために、Lys355 を指すシュウ酸塩のカルボン酸部分をシュウ酸塩結合閉塞構造内の水素原子に置き換えて、ギ酸塩-OxlT 複合体の初期構造を生成しました。 さらに、負電荷の損失を補うために、K+ イオンが以前のモデルから削除され、水分子に置き換えられました。 GAFF 力場パラメータ 79 がフォーマットに使用されました。 上で説明したのと同じ平衡化および生成プロトコルを実行しました。 平衡化ステップの最後に OxlT タンパク質が完全に緩和されると、より小さいリガンドの結合部位が適切に調整され、製造実行に現実的な立体構造が保証されます。

シミュレーション システムの概要として、初期構造 (外側に開いた構造または閉塞構造)、Lys355 のプロトン化状態、および結合リガンド (シュウ酸塩またはギ酸塩、閉塞構造の場合) の異なる組み合わせを持つ 4 つのシステムを構築しました。構造）。 補足表 5 では、これらのシミュレーション システム、軌道の数、合計シミュレーション時間がまとめられています。

シュウ酸塩の OxlT に対する相対結合自由エネルギーは、プログラム MMPBSA.py83 で実装された MM/GBSA 法によって計算されました。 MM/GBSA 法では、結合自由エネルギーは気相エネルギーと溶媒和エネルギーに分解され、分子力学力場 (MM) と溶媒接触表面積 (GBSA) を使用した一般化ボルン陰的溶媒モデルによって計算されます。それぞれ。 エントロピー効果は計算に含まれていないことに注意してください。 閉塞状態から外向きに開いた状態への構造遷移を示す軌跡を分析しました（図4d、f、および補足図13a）。 軌道は 3 つの段階に分割されました: シュウ酸二面体が約 50° の閉塞された OxlT (0 ～ 40 ns; OxlT-occ-dih50 と表記)、シュウ酸二面角が約 90° の閉塞された OxlT (41 ～ 320 ns; OxlT) -occ-dih90）とシュウ酸二面体が約90°の外向きに開いたOxlT（321–1000 ns; OxlT-op-dih90）。 MM/GBSA 結合自由エネルギーは、各軌道段階で決定されました (補足表 4 を参照)。

シミュレーション中の水の密度は、タンパク質が中心に配置されて重ね合わされた後、MDAnalysis84 のモジュールによって計算されました。

いくつかの QM/MM モデルをシュウ酸結合構造 (PDB ID 8HPK) で使用して、シュウ酸の内部立体構造に対する結合部位環境の関連性を評価しました。 まず、シュウ酸リガンドが QM 部分に割り当てられ、タンパク質全体が MM 部分に割り当てられました。 次に、リガンドと直接相互作用する残基の最初のシェル (Gln34、Tyr35、Tyr124、Arg272、および Lys355) が QM 部分に追加されました。 第三に、結合部位の 2 番目のシェル (Tyr150、Trp324、Tyr328、および Trp352) を QM 部分に追加して、シュウ酸リガンドを囲む完全な結合部位環境を構築しました。 すべての QM/MM 計算は、Gaussian 1686 で実装された ONIOM85 で実行されました。密度汎関数理論 (DFT) 法 87,88 を使用して、理論の B3LYP/6-31 + G(d,p) レベルで QM 領域を処理しました 89 ,90、Becke−Johnson 減衰による Grimme の分散補正 (D3BJ)91 を含みます。 システムの MM 領域は、MD シミュレーションと同じ力場によって記述されました。 電子埋め込みスキームは、MM 領域が QM 電子密度を分極するように使用されました。 QM 部分と MM 部分の間の共有結合境界を処理するために、QM 領域に位置する各残基の α 炭素と β 炭素の間に明示的なリンク原子が追加されました。 ポテンシャルエネルギー面の最小値は、虚数周波数がないことによって確認されました。 結合部位残基の側鎖が固定されたシュウ酸リガンドの追加の純粋な DFT 計算を、QM/MM 計算と同じ QM レベルの理論で実行しました。 QM/MM 計算と同様、ポテンシャル エネルギー面上の静止点として得られた最適化された構造は、虚数周波数のない真のエネルギー最小値でした。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

OxlT の座標および構造因子は、アクセッション番号 8HPK (OxlT-fab 複合体、シュウ酸結合閉塞型)92 および 8HPJ (OxlT-Fv 複合体、リガンドフリーの外向き型)93 でタンパク質データバンクに寄託されています。 MD 関連データは Zenodo リポジトリ [https://doi.org/10.5281/zenodo.7597686]94 に保管されています。 この研究では、PDB ID 1PW458、1XF459、5B3N60、4U4W95、4U4T96 および OFA ファミリーのアミノ酸配列 (IPR026355) との座標が使用されました。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

マレンゴ、SR およびロマーニ、AM 腎結石症におけるシュウ酸塩: 消えない終末期代謝物。 ナット。 クリン。 練習してください。 ネフロル。 4、368–377 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Massey、LK 食品シュウ酸塩: 測定、生物学的変動、および生物学的利用能に影響を与える要因。 混雑する。 ダイエット。 准教授 107、1191–1194 (2007)。

論文 PubMed Google Scholar

Miller, AW & Dearing, D. 哺乳類の腸内におけるシュウ酸分解細菌の代謝的および生態学的相互作用。 病原体 2、636–652 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アリソン、MJ、ドーソン、KA、メイベリー、WR & フォス、JG Oxalobacter formigenes gen. 11月、sp. 11 月: 消化管に生息するシュウ酸分解嫌気性菌。 アーチ。 微生物。 141、1–7 (1985)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ダニエル、SL 他オキサロバクター・フォルミジェネスを40年間研究してきた、根性のあるシュウ酸分解の専門家。 応用環境。 微生物。 87、e0054421 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

Mehta, M.、Goldfarb, DS、Nazzal, L. 腎臓結石形成におけるマイクロバイオームの役割。 内部。 Ｊ．Ｓｕｒｇ． 36、607–612 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Sidhu, H. et al. 嚢胞性線維症患者におけるオキサロバクター・フォルミジェネスの欠如：高シュウ酸尿症の危険因子。 ランセット 352、1026–1029 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kumar, R.、Ghoshal, UC、Singh, G. & Mittal, RD 炎症性腸疾患におけるオキサロバクター・フォルミジェネスの定着頻度: 腎結石形成における役割の可能性。 Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ヘパトール。 19、1403–1409 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

アリソン、MJ、クック、HM、ミルン、DB、ギャラガー、S. & クレイマン、RV ヒトの胃腸細菌によるシュウ酸塩の分解。 Ｊ．Ｎｕｔｒ． 116、455–460 (1986)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pao、SS、Paulsen、IT & Saier、MH Jr. 主要なファシリテーターのスーパーファミリー。 微生物。 モル。 バイオル。 改訂 62、1–34 (1998)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Anantharam、V.、Allison、MJ & Maloney、PC シュウ酸塩:ギ酸塩交換。 オキサロバクターにおけるエネルギー結合の基礎。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 264、7244–7250 (1989)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ルアン、ZSら。 Oxalobacter formigenes のシュウ酸:ギ酸アンチポートタンパク質である OxlT の同定、精製、および再構成。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 267、10537–10543 (1992)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Maloney, PC、Anantharam, V. & Allison, MJ 可溶化膜担体の基質解離定数の測定。 Oxalobacter formigenes の陰イオン交換タンパク質である OxlT の基質の安定化。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 267、10531–10536 (1992)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pajor、AM SLC13 ファミリーのナトリウム結合ジカルボン酸およびクエン酸トランスポーター。 プラグ。 アーチ。 466、119–130 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

エイブラムソン、J. et al. 大腸菌の乳糖透過酵素の構造と機構。 サイエンス 301、610–615 (2003)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Huang, Y.、Lemieux, MJ、Song, J.、Auer, M. & Wang, DN 大腸菌由来のグリセロール-3-リン酸トランスポーターの構造と機構。 サイエンス 301、616–620 (2003)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Jardetzky, O. 膜ポンプの単純なアロステリック モデル。 Nature 211、969–970 (1966)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Yan、N. 主要な促進因子スーパーファミリートランスポーターの構造生物学。 アンヌ。 Rev.Biophys. 44、257–283 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Quistgaard, EM、Low, C.、Guettou, F.、Nordlund, P. 主要促進者スーパーファミリー (MFS) による輸送の理解: 構造が道を切り開く。 ナット。 モル牧師。 セルバイオル。 17、123–132 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Drew, D.、North, RA、Nagarathinam, K. & Tanabe, M. 主要促進因子スーパーファミリー (MFS) による構造と一般的な輸送メカニズム。 化学。 改訂 121、5289–5335 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

平井 哲 ほか細菌のシュウ酸トランスポーターの三次元構造。 ナット。 構造体。 バイオル。 9、597–600 (2002)。

CAS PubMed Google Scholar

平井 T. & Subramaniam, S. 細菌のシュウ酸トランスポーター OxlT の構造と輸送機構。 生物物理学。 J. 87、3600–3607 (2004)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ihara, M.、松浦, N. & 山下, A. 蛍光検出と流体力学的状態評価が可能な膜タンパク質の高解像度 Native-PAGE。 アナル。 生化学。 412、217–223 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hunte, C. & Michel, H. 抗体断片によって媒介される膜タンパク質の結晶化。 カー。 意見。 構造体。 バイオル。 12、503–508 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bukowska, MA & Grutter, MG 結晶化を促進するための新しい概念と補助具。 カー。 意見。 構造体。 バイオル。 23、409–416 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

福田正人 ほか NarKによる硝酸塩/亜硝酸塩対港の動的機構の構造的基礎。 ナット。 共通。 6, 7097 (2015)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

野村伸一 ほか哺乳類のフルクトーストランスポーター GLUT5 の構造とメカニズム。 ネイチャー 526、397–401 (2015)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Javadpour, MM、Eilers, M.、Groesbeek, M. & Smith, SO ポリトピック膜タンパク質におけるヘリックスパッキング: 膜貫通ヘリックス会合におけるグリシンの役割。 生物物理学。 J. 77、1609–1618 (1999)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng, H.、Wisechaisri, G.、および Gonen, T. 硝酸塩/亜硝酸塩交換体の結晶構造。 ネイチャー 497、647–651 (2013)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ディーン、PAW シュウ酸ジアニオン、C2O42-: 平面か非平面か? Ｊ．Ｃｈｅｍ． 教育する。 89、417–418 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Fu, D.、Sarker, RI、Abe, K.、Bolton, E. & Maloney, PC Oxalobacter formigenes のシュウ酸-ギ酸トランスポーターである OxlT の構造と機能の関係。 膜貫通ヘリックス 11 の移行経路への割り当て。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 276、8753–8760 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ヤン、Q.ら。 Oxalobacter formigenes のシュウ酸トランスポーターである OxlT の相同性モデルの実験的テスト。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 102、8513–8518 (2005)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, X.、Saker, RI & Maloney, PC Oxalobacter formigenes のシュウ酸:ギ酸対向輸送体である OxlT の基質結合要素の分析。 生化学 45、10344–10350 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wang, X.、Ye, L.、McKinney, CC、Feng, M. & Maloney, PC TM5 のシステイン スキャニング突然変異誘発により、Oxalobacter formigenes のシュウ酸トランスポーターである OxlT の構造変化が明らかになります。 生化学 47、5709–5717 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Nji, E.、Chatzikyriakidou, Y.、Landreh, M. & Drew, D. 操作されたサーマルシフト スクリーニングにより、真核生物および原核生物の膜タンパク質の特異的な脂質優先性が明らかになります。 ナット。 共通。 9、4253 (2018)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

林 正、小島 和、須藤 裕、山下 明。光駆動プロトンポンプを共発現する大腸菌を用いた電気発生トランスポーターの光遺伝学的アッセイ法。 タンパク質科学。 30、2161–2169 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bosdriesz、E. et al. 低親和性ユニポーターキャリアタンパク質は、流出を減らすことで正味の基質取り込み速度を高めることができます。 科学。 議員第8号、5576号（2018年）。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, XC、Zhao, Y.、Heng, J. & Jiang, D. MFS トランスポーターのエネルギー結合メカニズム。 タンパク質科学。 24、1560–1579 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

岡崎 KI ほか遷移経路射撃による電気中性ナトリウム/プロトン対向輸送体PaNhaPのメカニズム。 ナット。 共通。 1742 年 10 日 (2019 年)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koziolek、M. et al. intellicap((R)) システムを使用した、絶食したヒト被験者の消化管内の pH および温度プロファイルの調査。 Ｊ．Ｐｈａｒｍ． 科学。 104、2855–2863 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Takayama, Y.、Castaneda, CA、Chimenti, M.、Garcia-Moreno, B.、Iwahara, J. タンパク質の疎水性コアに埋もれたリジン側鎖の脱プロトン化に関する直接的な証拠。 混雑する。 化学。 社会 130、6714–6715 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Feng, J.、Selvam, B. & Shukla, D. 対向輸送体はどのようにして細胞膜を越えて基質を交換するのでしょうか? NarK における完全な交換サイクルの原子レベルの記述。 構造 29、922–933.e923 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kroutil, O.、Predota, M.、Kabelac, M. スケーリングされた電荷によるシュウ酸水素およびシュウ酸アニオンの力場パラメータ化。 Ｊ．Ｍｏｌ． モデル 23、327 (2017)。

論文 PubMed Google Scholar

Stelzl, LS、Fowler, PW、Sansom, MS & Beckstein, O. 柔軟なゲートは、LacY の輸送サイクルで閉塞された中間体を生成します。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 426、735–751 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ブルーム、M.ら。 InterPro タンパク質ファミリーとドメインのデータベース: 20 年。 核酸研究所 49、D344–D354 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Abe、K.、Ruan、ZS、および Maloney、PC Oxalobacter formigenes のシュウ酸:ギ酸交換タンパク質である OxlT の大腸菌でのクローニング、配列決定、および発現。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 271、6789–6793 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Fu, D. & Maloney, PC 円二色性分光法による、Oxalobacter formigenes のシュウ酸トランスポーターである OxlT の二次構造の評価。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 272、2129–2135 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジェネッケ、F. et al. 多剤耐性トランスポーター MdfA の結晶化のための構造特異的抗体フラグメントの生成。 方法 Ｍｏｌ． バイオル。 1700、97–109 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

スハルニら。 ヒト M2 ムスカリン性アセチルコリン受容体に対する組換え抗体フラグメントのプロテオリポソームに基づく選択。 モノクロン。 抗生剤。 免疫診断。 免疫力のない人。 33、378–385 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

野村祐也 ほか介在する取り外し可能なアフィニティータグ (iRAT) 生成システムにより、Fv 抗体フラグメントを介した結晶解析が容易になります。 タンパク質科学。 25、2268–2276 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

上野 G.、神田 英、熊坂 哲、山本 M. Beamline Scheduling Software: SPring-8 の理研構造ゲノミクスビームラインを自動運用するための管理ソフトウェア。 J.シンクロトロン放射。 12、380–384 (2005)。

論文 PubMed Google Scholar

山下和也、平田和也、山本正史、加茂：微結晶の自動データ処理に向けて。 アクタクリスタログル。 D 構造体。 バイオル。 74、441–449 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Foadi、J. et al. 高分子結晶学における複数の結晶からデータセットを最適に選択するためのクラスタリング手順。 アクタクリスタログル。 Dバイオル。 クリスタロガー。 69、1617–1632 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カブシュ、W. XDS。 アクタクリスタログル。 Dバイオル。 クリスタロガー。 66、125–132 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kabsch, W. 統合、スケーリング、空間グループの割り当て、および事後精製。 アクタクリスタログル。 Dバイオル。 クリスタロガー。 66、133–144 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tickle、IJ et al. スタラニソ https://staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi (2018)。

マッコイ、AJ 他フェイザー結晶解析ソフトウェア。 Ｊ．Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． 40、658–674 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, Y.、Lemieux, MJ、Song, J.、Auer, M. & Wang, DN 大腸菌由来のグリセロール-3-リン酸トランスポーターの結晶構造。 タンパク質データバンク https://doi.org/10.2210/pdb1PW4/pdb (2003)。

Schuermann, JP、Prewitt, SP、Deutscher, SL & Tanner, JJ 完全な半面体双晶を有する結晶から解析された空間群 P321 のリガンドフリー Fab DNA-1 の構造。 タンパク質データバンク https://doi.org/10.2210/pdb1XF4/pdb (2005)。

鯨井 哲也、堀越 直也、胡桃坂 英. anti-H4K20me1_scFv、15F11 の結晶構造。 タンパク質データバンク https://doi.org/10.2210/pdb5B3N/pdb (2016)。

Emsley, P.、Lohkamp, B.、Scott, WG & Cowtan, K. オオバンの特徴と開発。 アクタクリスタログル。 Dバイオル。 クリスタロガー。 66、486–501 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アダムス、PD 他。 PHENIX: 高分子構造ソリューションのための包括的な Python ベースのシステム。 アクタクリスタログル。 Dバイオル。 クリスタロガー。 66、213–221 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

デイビス、IWら。 MolProbity: タンパク質と核酸の全原子接触と構造検証。 核酸研究所 35、W375–W383 (2007)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

ニュージャージー州グリーンフィールド 温度の関数として収集された円二色性を使用して、タンパク質のアンフォールディングと結合相互作用の熱力学を決定します。 ナット。 プロトック。 1、2527–2535 (2006)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, Y. 他トリオースリン酸/リン酸トランスロケーターの構造は、基質特異性の基礎を明らかにします。 ナット。 Plants 3、825–832 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Webb, B. & Sali, A. MODELLER を使用したタンパク質構造の比較モデリング。 カー。 プロトック。 バイオインフォーム。 54、5 6 1–5 6 37 (2016)。

記事 Google Scholar

Sondergaard, CR、Olsson, MH、Rostkowski, M. & Jensen, JH pKa 値の経験的計算と合理化におけるリガンドとカップリング効果の処理を改善しました。 Ｊ．Ｃｈｅｍ． 理論計算。 7、2284–2295 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Olsson, MH、Sondergaard, CR、Rostkowski, M. & Jensen, JH PROPKA3: 経験的 pKa 予測における内部および表面残基の一貫した処理。 Ｊ．Ｃｈｅｍ． 理論計算。 7、525–537 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Jo, S.、Kim, T.、Iyer, VG & Im, W. CHARMM-GUI: CHARMM 用の Web ベースのグラフィカル ユーザー インターフェイス。 Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ． 化学。 29、1859–1865 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウー、ELら。 CHARMM-GUI リアルな生体膜シミュレーションを実現する膜ビルダー。 Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ． 化学。 35、1997–2004 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chamberlain, CA、Hatch, M. & Garrett, TJ UHPLC-HRMS によるオキサロバクター フォルミジェネス HC1 株および OxWR 株のメタボロミクスおよびリピドミクス特性評価。 アナル。 バイオアナル。 化学。 411、4807–4818 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

エイムズ、GF ネズミチフス菌および大腸菌の脂質: 構造と代謝。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 95、833–843 (1968)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ケース、DA et al. AMBER 2017 (サンフランシスコ、カリフォルニア大学、2017)。

フィリップス、JC et al. NAMD を使用した CPU および GPU アーキテクチャ上のスケーラブルな分子動力学。 Ｊ．Ｃｈｅｍ． 物理学。 153、044130 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マイヤー、JA et al. ff14SB: ff99SB からタンパク質の側鎖とバックボーンのパラメーターの精度が向上しました。 Ｊ．Ｃｈｅｍ． 理論計算。 11、3696–3713 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ディクソン、CJ 他 Lipid14: 琥珀色の脂質力場。 Ｊ．Ｃｈｅｍ． 理論計算。 10、865–879 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kroutil, O.、Minofar, B. & Kabelac, M. 溶媒和シュウ酸水素アニオンおよびシュウ酸アニオンの構造と動力学: 理論的研究。 Ｊ．Ｍｏｌ． モデル。 22、210 (2016)。

論文 PubMed Google Scholar

Bayly, CI、Cieplak, P.、Cornell, WD & Kollman, PA 原子電荷を導出するために電荷拘束を使用する、行儀の良い静電ポテンシャルに基づく方法 - RESP モデル。 Ｊ．Ｐｈｙｓ． 化学。 97、10269–10280 (1993)。

記事 CAS Google Scholar

Wang, J.、Wolf, RM、Caldwell, JW、Kollman, PA & Case, DA 一般的なアンバー力場の開発とテスト。 Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ． 化学。 25、1157–1174 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ミノファー、B.ら。 ジカルボン酸ジアニオンのバルク水溶媒和と界面水溶媒和。 混雑する。 化学。 社会 126、11691–11698 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Darvas, M.、Picaud, S. & Jedlovszky, P. 氷表面へのシュウ酸の吸着の分子動力学シミュレーション。 Chemphyschem 11、3971–3979 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Riley, JM、Kim, H.、Averch, TD & Kim, HJ カルシウムとシュウ酸イオンの結合に対するマグネシウムの効果。 J.エンドロール。 27、1487–1492 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ミラー、BR 3rd 他 MMBSA.py: 最終状態の自由エネルギー計算のための効率的なプログラム。 Ｊ．Ｃｈｅｍ． 理論計算。 8、3314–3321 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Michaud-Agrawal, N.、Denning, EJ、Wolf, TB & Beckstein, O. MDAnalysis: 分子動力学シミュレーションの解析用ツールキット。 Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ． 化学。 32、2319–2327 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chung、LW et al. ONIOM メソッドとその応用。 化学。 Rev. 115、5678–5796 (2015)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

フリッシュ、MJ et al. Gaussian 16、改訂 C.01 (Gaussian, Inc.、2016)。

Hohenberg, P. & Kohn, W. 不均一電子ガス。 物理学。 改訂 136、B864–B871 (1964)。

記事 ADS MathSciNet Google Scholar

Kohn, W. & Sham, LJ 交換効果と相関効果を含む自己矛盾のない方程式。 物理学。 改訂 140、A1133–A1138 (1965)。

記事 ADS MathSciNet Google Scholar

Becke, AD 密度汎関数熱化学。 Ⅲ． 正確な交換の役割。 Ｊ．Ｃｈｅｍ． 物理学。 98、5648–5652 (1993)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Lee, C.、Yang, W. & Parr, RG Colle-Salvetti の相関エネルギー式を電子密度の汎関数に展開。 物理学。 Rev. B コンデンス。 問題 37、785–789 (1988)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Grimme, S.、Ehrlich, S. & Goerigk, L. 分散補正密度汎関数理論における減衰関数の効果。 Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ． 化学。 32、1456–1465 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

島村 哲、平井 哲、山下 明。シュウ酸結合閉塞型の細菌シュウ酸トランスポーター OxlT の結晶構造。 タンパク質データバンク https://doi.org/10.2210/pdb8HPK/pdb (2023)。

島村 哲、平井 哲、山下 明。リガンドを含まない外向きの形の細菌シュウ酸トランスポーター OxlT の結晶構造。 タンパク質データバンク https://doi.org/10.2210/pdb8HPJ/pdb (2023)。

Jaunet-Lahary, T. & 岡崎, KI 「腸内細菌叢のシュウ酸分解細菌におけるシュウ酸トランスポーター OxlT の構造と機構」のデータ。 ゼノド https://doi.org/10.5281/zenodo.7597686 (2023)。

福田正人 ほか硝酸塩結合閉塞状態の硝酸塩/亜硝酸塩対向輸送体 NarK の構造。 タンパク質データバンク https://doi.org/10.2210/pdb4U4W/pdb (2015)。

福田正人 ほか硝酸塩が結合して内向きに開いた状態の硝酸塩/亜硝酸塩対向輸送体 NarK の構造。 タンパク質データバンク https://doi.org/10.2210/pdb4U4T/pdb (2015)。

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博士たちに感謝します。 X線回折データ収集支援にはSPring-8の長谷川和也氏、奥村英夫氏、川野義明氏、平田邦夫氏。 野村弥生氏、中田名倉佳子氏、佐藤由美氏には抗体生成における技術支援をいただきました。 藤田京子氏には機能アッセイに関する技術支援をしていただきました。 OxlT 機能アッセイに関する貴重なアドバイスをいただいた安部恵悦教授。 放射光実験は、高輝度光科学研究センター（JASRI）の承認を得て、SPring-8のBL41XUおよびBL32XUで実施されました（提案番号2012B1096、2015A1080、2015B2080）。 計算の一部は、岡崎市にある計算科学研究センター (プロジェクト: 21-IMS-C175、22-IMS-C189) を使用して実行されました。 この研究は、JSPS 科研費 JP20H03195 (AY へ)、JP18H02415 (KO へ)、JP26440086 (TH へ) および小柳財団 (AY へ)、武田科学財団 (Ta.S. へ) からの研究資金によって財政的に支援されました。 AMED創薬・ライフサイエンス研究支援プラットフォーム事業【革新的創薬・ライフサイエンス研究支援基盤（BINDS）】 JP20am0101079 (SI 宛)。 著者らは、英語のレビューをしていただいた Enago (www.enago.jp) に感謝いたします。

自然科学研究機構分子科学研究所計算科学研究センター〒444-8585 岡崎市

Titouan Jaunet-Lahary & Kei-ichi Okazaki

京都大学大学院医学研究科, 京都市, 606-8501

Tatsuro Shimamura, Norimichi Nomura, Kouta Hirasawa & So Iwata

岡山大学大学院医歯薬学総合研究科

Masahiro Hayashi, Naotaka Tsutsumi, Keiichi Kojima, Yuki Sudo & Atsuko Yamashita

理化学研究所 スプリングエイトセンター、〒679-5148 佐用市

Tetsuya Shimizu, Masao Yamashita, Teruhisa Hirai & Atsuko Yamashita

岡山大学薬学部、〒700-8530 岡山県

Naotaka Tsutsumi, Yuta Suehiro & Atsuko Yamashita

岡山大学大学院環境生命科学研究科, 岡山市, 700-8530

Takashi Tamura

東京大学先端科学技術研究センター、〒153-8904 東京

Hiroko Iwanari & Takao Hamakubo

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Te.H. そしてAYがこの研究を発案した。 Te.S.、MY、Ta.S.、KH、NN がタンパク質の精製を行いました。 NN、HI、Ta.H.、および SI は抗体の調製を実行しました。 Te.S.、MY、AY、Te.H.、Ta.S.、KH が結晶化と X 線データ収集を実施しました。 Ta.S.、Te.H.、MH、AY が構造解析を行いました。 MH、NT、Yut.S.、KK、AY、Yuk.S. 機能アッセイを実施しました。 TJL と KO は分子動力学と QM/MM シミュレーションを実行しました。 TT は予備的な分子動力学シミュレーションを実行しました。 AY、KO、Ta.S.、NN、TJL、MH、NT、Yut.S. 他の著者全員からの意見を取り入れて論文を執筆しました。

Correspondence to Tatsuro Shimamura, Kei-ichi Okazaki, Teruhisa Hirai or Atsuko Yamashita.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Lan Guan と他の匿名の査読者に感謝します。 査読レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Jaunet-Lahary, T.、島村, T.、林, M. 他腸内細菌叢のシュウ酸分解細菌におけるシュウ酸トランスポーター OxlT の構造と機構。 Nat Commun 14、1730 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36883-5

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受信日: 2021 年 11 月 1 日

受理日: 2023 年 2 月 20 日

公開日: 2023 年 4 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36883-5

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