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Sep 29, 2023

治療用組換え抗体の毒性試験用のヒト化ミニブタモデル

Ingegneria Biomedica della Natura

Nature Biomedical Engineering volume 6、pages 1248–1256 (2022)この記事を引用

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15 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ほとんどのヒト組換えタンパク質の安全性は、特定のヒトタンパク質に耐性のあるトランスジェニックマウスで評価できます。 しかし、遺伝的多様性が不十分であったり、免疫機構が根本的に異なっていたりするため、ヒト疾患の小動物モデルは免疫原性試験やヒト患者の有害転帰の予測には適さないことが多い。 ほとんどのヒト治療用抗体は、野生型動物において異種反応を引き起こし、その結果、薬物の急速なクリアランスを引き起こすため、ヒト抗体の in vivo 毒物学的検査が困難になります。 今回我々は、免疫グロブリン重鎖γ1およびγ4と免疫グロブリン軽鎖κのヒト遺伝子のミニレパートリーを保有するゲッティンゲンミニブタの作製を報告する。 ヒト患者での観察と一致して、遺伝子組み換えミニブタは臨床的に非免疫原性の IgG1κ アイソタイプモノクローナル抗体ダラツムマブおよびベバシズマブに耐性を示し、チェックポイント阻害剤アテゾリズマブおよび人工インターロイキンセルグツズマブ・アムナロイキンに対する抗体を誘発した。 ヒト化ミニブタは、治療用抗体の安全性と有効性の試験を容易にすることができます。

化合物の投与によりヒトに免疫反応が引き起こされる場合、モノクローナル抗体 (mAb) の有効性と安全性が損なわれる可能性があります。これは、抗薬物抗体 (ADA) の発生によって示されます。 いくつかの要因が ADA を誘発する可能性があり、患者、疾患、製品、または治療に関連するものとして分類されます。 これらは、軽度から生命を脅かす症状を引き起こす可能性があり、臨床的に承認されているいくつかの治療用タンパク質について十分に文書化されています1。 これらの副作用は化合物によって異なり、予測するのが困難です。 ADA の薬物動態、その中和能力、および内因性分子や他の生物学的化合物との交差反応性の理解には、依然として大きなギャップがあります。

これらの欠点に対処するために、いくつかの異なる前臨床 in silico および in vitro モデルが開発されています 2、3、4、5、6、7。 in vivo モデルにおける免疫原性の評価には、無傷の免疫系を考慮した動物実験が含まれます。 しかし、種の違いにより、ヒトのタンパク質はおそらく、実験動物に免疫反応を引き起こす可能性があります。 これは、動物種に特異的な代替抗体（ただしその予測値には疑問の余地がある）、またはヒトタンパク質を発現してそれを「自己」として認識するトランスジェニック動物を使用することで回避できます。 したがって、引き起こされる免疫応答は、組換えタンパク質の状態の変化によるものとなります。 個々の治療用タンパク質に対して個別のトランスジェニック動物系統の作製を避けるために、我々を含むいくつかの研究グループは、ヒト免疫グロブリン遺伝子のセットを発現するトランスジェニックマウスを作製した8、9、10。 Ab 発見のためのほとんどの抗体 (Ab) ヒト化マウス モデルとは対照的に、当社のトランスジェニック動物は依然として内因性免疫グロブリン遺伝子 (Ig) を発現しているため、完全に免疫能を備えています。 ヒト Ig 導入遺伝子の機能は寛容を誘導することだけであり、必ずしも免疫応答に関与する必要はありません。 したがって、我々が確立したマウス系統は、分泌型のヒト Ig-γ1 重鎖、ならびに Ig-κ および Ig-λ 軽鎖のみで構成されるヒト IgG1 ミニレパートリーを保有しています。 含まれる遺伝子は、ヒトおよび治療用抗体の産生に最も一般的に使用される遺伝子です11。 これらのトランスジェニック マウスを使用すると、ヒト治療用抗体のカテゴリー全体の免疫原性研究や、Ab 調製物における潜在的な免疫原性修飾の評価が可能になります 10。 しかし、明らかな解剖学的および寿命の理由から、マウスで得られたデータは、適用経路、薬物動態および長期毒性評価の点で必ずしもヒトに直接応用できるわけではありません12。 国際調和評議会 (ICH) の人間用医薬品登録に関する技術要件は、齧歯類 1 種と非齧歯類 1 種における前臨床安全性試験を義務付けています。 治療用抗体の場合、多くの場合、非ヒト霊長類 (NHP) が唯一の選択肢となります。 ヒト組換え Ab の免疫原性および免疫毒性特性の可能性を評価するための汎用の非げっ歯類、非 NHP モデルが利用可能であれば、貴重なツールとなるでしょう。 これにより、この急速に成長する市場の前臨床安全性が強化されるでしょう。

ブタは、体の大きさ、多くの器官系の解剖学的構造、生理学的および病態生理学的な反応においてヒトに似ているため、前臨床研究に多くの利点を持っています。 ブタは、妊娠期間が比較的短く、同腹子の数が多く、急速に成熟し、特定の病原体のない条件下で飼育しやすいという特徴を持っています。 重要なのは、ヒトとの免疫学的類似性により、ブタは前臨床研究の理想的なモデルとなっている13、14、15。 マウスと同様に、ブタでも遺伝子組み換え手法が確立されています。

以前のマウスの結果 10 に基づいて、ヒト Ig 重鎖 (IGH) および Ig κ 軽鎖 (IGK) 鎖遺伝子の同様のレパートリーを持つトランスジェニック ゲッティンゲン ミニブタが作られました。 プロジェクトの概要を図 1a に示します。 2 つの発現ベクターが生成されました。 最初の構築物には、分泌型ヒト IgG1 (hIgG1) H 鎖の産生を駆動するために必要な配列と組み合わせて、5 つの可変 (V)、5 つの多様性 (D)、および 6 つの結合 (J) 要素をコードする再構成されていない生殖系列 IGH 遺伝子セグメントが含まれます。 hIgG1だけでなくhIgG4アイソタイプも発現できるかどうかを評価するために、定常γ4（Cγ4）領域および対応するスイッチ配列（Sμ、Iγ-Sγ）もこの構築物に含めました（図1b、IGH-γ1-γ4; NCBI アクセッション番号: OL809665)。 ヒト IgG1 と hIgG4 は、ヒト治療用 mAbs で最も一般的に使用される 2 つの Ig アイソタイプであるため、選択されました 16。 IGH-γ1-γ4 構築物は、Ig アイソタイプを Cγ1 から Cγ4 に切り替えることを可能にするはずです。 2番目の構築物には、2Vおよび5J要素をコードするIGK遺伝子セグメントと、κ定常（C）領域をコードする配列が含まれます（図1c、IGK、NCBIアクセッション番号：OL809666）。 適切に再構成されると、これらの遺伝子要素は、内因性ブタ Ig タンパク質の再構成およびレパートリー形成のプロセスを妨げることなく、ヒト可溶性 IgG タンパク質のレパートリーを生成するはずです。これは、これには膜結合型ヒト Ig タンパク質の発現が必要であるためです。トランスジェニック構築物（図１ｂを参照）。 構築物で使用されるすべての V 遺伝子は、ヒト末梢血での主な使用に基づいて選択され 11、ヒト IgG1 Abs に対する広範な耐性を提供することがトランスジェニック マウス モデルで示されました。

a, ヒト IgG トランスジェニック ミニブタの生成と応用を示すプロジェクトの概要。 b、免疫グロブリン重鎖 (IGH-γ1-γ4) の分泌型、および c、κ 軽鎖 (IGK)。 BioRender.com で作成された図。

雄のゲッティンゲン ミニブタから単離した腎臓線維芽細胞に、IGH-γ1-γ4 (31.4 kb) および IGK (10.9 kb) 発現ベクター、および選択マーカー遺伝子 (ホスホグリセリン酸キナーゼ (PGK) 駆動ブラストサイジン、BS; 1.05 kb) を同時トランスフェクトしました。 。 単一細胞クローンを単離し、3 つすべての導入遺伝子の存在について PCR によってスクリーニングしました。 4 ～ 5 個の細胞クローンがプールされ、体細胞核移植に使用され、8 頭の生きた雄のゲッティンゲン子豚が誕生しました。 すべてが 3 つの導入遺伝子の存在について陽性でした (図示せず)。 4 頭の創始動物が性成熟に達しました (TG1 ～ TG4)。 ドロップレット PCR で測定したところ、4 つすべてが 2 コピーのヒト IGH-γ1-γ4 および IGK 導入遺伝子を保有していましたが、選択マーカー遺伝子のコピー数が異なりました (TG1 ～ TG3、1 コピー、TG4、3 コピー)。 TG4 を除いて、すべての創始動物はヒト IgG 重鎖 (HC) および軽鎖 (LC) を発現しました (図 2)。 したがって、TG1 ～ TG3 のみがさらなる育種に使用されました。 すべての子孫（F1〜F3）はメンデル導入遺伝子の遺伝を示し、単一のゲノム遺伝子座での挿入を示し、創始者と子孫は血清中のヒトIgGのレベルが同様であり（図2a、b）、再現可能な表現型（図3および4）を示しました。 。 ヒト IgG1 トランスジェニック マウス 10 とは対照的に、トランスジェニック ミニブタではハイブリッド (ヒト/ブタ) IgG1 分子は検出されませんでした。 ヒト Igκ LC を捕捉し、ヒト Ig HC を検出する二重抗体サンドイッチ ELISA により、完全ヒト IgG の発現が実証されました (拡張データ図 1)。

a、トランスジェニック創始者（TG1〜TG3）IgGミニブタおよびTG2およびTG3系のF1動物から単離された血清中のIgG重γ1（IgH-γ1）およびκ軽（IgL-κ）タンパク質の発現を示すウェスタンブロット。 WT ゲッティンゲン ミニブタは、両方のタンパク質の存在について陰性でした。 ヒト IgG タンパク質と PBS をそれぞれポジティブコントロールとネガティブコントロールとして使用しました。 すべてのウェスタンブロットの未処理の画像を補足データ1に示します。 b、ヒトIgG1タンパク質の存在は、3系統すべてを表すF1ミニブタから単離された血清中のELISA分析によってさらに確認されました（TG系統1、n = 5、TG系統2、 n = 4; TG ライン 3、n = 3)。 WT 動物ではヒト IgG1 は検出されませんでした (n = 4)。 水平バーは中央値を表します。 各データ ポイントは生物学的複製を表します。 c、ヒト IgG 重鎖およびκ 軽鎖遺伝子は、機能的な遺伝子再構成を受けます。 4 つすべての VH と 2 つの Vκ 導入遺伝子の再構成の選択が示されています。 ヒトの VH および VK 遺伝子の再構成では、N ヌクレオチドの付加が示されます。 アイソタイプスイッチバリアントのヒト IgG4 配列は茶色で示されています。 再構成された V 遺伝子の J 要素を括弧内に示し、特定された D 遺伝子要素に下線を引いて右側に示します。

ソースデータ

a、ヒト IgG トランスジェニック ミニブタ (n = 2) は、ミョウバンアジュバント中の KLH による単回免疫化により、WT 動物 (n = 2) と同等のレベルでブタ IgG 抗 KLH 抗体応答を開始します。 b、ヒト IgG トランスジェニック ミニブタ (n = 2) は、35 日目に KLH で再攻撃した後、記憶応答を開始することができます (矢印)。 赤い点線は力価 200 での任意の閾値を示します。二元配置分散分析 (ANOVA) による統計分析。 NS、重要ではありません。 水平バーは中央値を表します。 各データ ポイントは生物学的複製を表します。

ソースデータ

a、アジュバントを使用しない免疫化戦略の概略図。 ADA 分析用の血液サンプルは、各治療前に採取されます。 b、6匹のhIgGトランスジェニック(TG)創始者ミニブタおよび6匹のWT対照をベバシズマブで免疫した後のブタIgG抗ベバシズマブ抗体力価。 データは、それぞれ 2 頭のトランスジェニック ミニブタと 2 頭の WT ミニブタを用いた 3 つの個別の研究から要約されました。 c、F1世代からの4頭のhIgGトランスジェニックミニブタおよび4頭のWT動物をベバシズマブで免疫した後のブタIgG抗ベバシズマブ抗体力価。 d、ダラツムマブで免疫したミニブタ（TG、n = 4; WT、n = 4）においてELISAによって測定されたブタIgG抗ダラツムマブ抗体のOD。 赤い点線は、力価 200 での任意の閾値、または OD の場合は平均 + 6 × sd 閾値を示します。 二元配置分散分析による統計分析。 水平バーは中央値を表します。 各データ ポイントは生物学的複製を表します。

ソースデータ

ブタ B リンパ球におけるヒト V 遺伝子セグメントの再構成を特徴付けるために、トランスジェニック ミニブタの末梢血からメッセンジャー RNA (mRNA) サンプルを単離しました。 配列分析により、ヒト可変重鎖（VH）およびカッパ軽鎖（VK）遺伝子セグメントの機能的V(D)J再配列、ならびに重鎖および軽鎖に対するNヌクレオチドの付加が確認された。 後者は、再構成された免疫グロブリンの接合部でのNヌクレオチド付加を担うブタターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)の機能中に、ヒト重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子が時間的に協調して再構成されることを示している。 これは、類似のマウスモデルでも観察されています10。 さらに、ヒトVH配列には、相補性決定領域の外側の体細胞変異によるアミノ酸交換が含まれていました（補足図1を参照）（図2c）。 hIgG トランスジェニック ミニブタの血清中の IgG4 タンパク質を検出する試みはすべて失敗しました。 ただし、RNA配列分析では、スイッチされたIgG4遺伝子の割合が少ないことが明らかになりました（0.76％、図2cおよび補足図1）。 これは、IgG アイソタイプ スイッチが発生することを証明していますが、これはまれな現象であり、ヒト IgG4 タンパク質が検出されなかった理由を説明します。 これらすべては、ブタとヒトのタンパク質が適合しており、ヒト IgG 遺伝子の再構成がトランスジェニック ミニブタで効率的に進行することを示しています。

hIgG 動物は健康であり、感染負荷の増加に悩まされていません。 動物の剖検では、脾臓、リンパ節、骨髄の正常な外観が示されました（データは示されていません）。

免疫能力は、T 細胞依存性モデル抗原キーホール リンペット ヘモシアニン (KLH) を使用して実験的にも確認され 16、これに対する応答はゲッティンゲン ミニブタで十分に文書化されています 17。 ２匹のｈＩｇＧおよび２匹の野生型（ＷＴ）ミニブタに、ミョウバンアジュバント中の２０ｍｇ／ｋｇ体重ＫＬＨの単回用量を皮下（ｓ．ｃ．）注射し、ＫＬＨ特異的抗体応答を３５日間追跡した。 4匹のミニブタはすべて、免疫後1週間でIgM（図示せず）およびIgG応答を開始し、導入遺伝子の発現がこのタンパク質に対するT細胞依存性Ab応答を変化させないことが確認されました（図3a）。 その後の追加免疫実験では、最初の KLH 投与に続いて、35 日目に 2 回目の投与を動物に再投与しました。追加免疫後の KLH 特異的ブタ IgG 力価の急速な増加は、ヒト化ミニブタが免疫力を増強する能力があることを示しています。記憶応答(図3b)。 予想通り、KLH 特異的ヒト IgG は検出されませんでした (データは示されていません)。 したがって、hIgG1 トランスジェニック マウスで以前に観察されたように 10、ヒト IgG の発現はゲッティンゲン ミニブタの免疫能力を損なうことはありません。

次に、我々は、典型的なヒト治療薬であるベバシズマブおよびダラツムマブに対するヒト化ミニブタの耐性状態を評価した。 どちらもヒト IgG1 アイソタイプの古典的な抗体であり、患者における免疫原性率は低い (1% 未満)。

ヒト IgG トランスジェニックおよび野生型ミニブタにベバシズマブを繰り返し注射しました (0.4 mg kg-1 体重、7 回注射；図 4a)。 血清サンプルを毎週収集し、ELISA によってブタ IgG ADA を測定しました。 ベバシズマブによる治療により、野生型ミニブタでは ADA が形成されましたが、hIgG 発現創始者ミニブタ (図 4b) やその F1 子孫 (図 4c) では形成されず、ヒト IgG1 に対する免疫寛容が実証され、形質の遺伝が確認されました。

ダラツムマブによる治療は、トランスジェニック動物でも野生型動物でも、ADA力価の実質的な増加を引き起こさなかった。 しかし、生データは、トランスジェニックミニブタグループには見られない、野生型動物におけるADAシグナルの弱いながらもかなりの遅い増加を明らかにした（図4d）。

すべての所見は、IgGトランスジェニックマウスからの以前の結果と一致しており、両方のAbが非免疫原性であることも判明しましたが、野生型マウスは強い（ベバシズマブ）または中程度（ダラツムマブ）のADA応答を示しました10（補足表1）。

治療用ヒト Ab の免疫原性を評価するためのこのモデルの可能性を決定するために、4 匹の hIgG および WT ミニブタのコホートを 0.4 mg kg-1 体重のアテゾリズマブまたはセルグツズマブで治療しました。 これらは、それぞれ患者の 39% と 70% で ADA 反応を誘発することが知られています 18,19。 すべてのミニブタは ADA 反応を発現しました。 セルグツズマブ アムナロイキンによる治療後のヒト IgG トランスジェニック ミニブタとその野生型同腹子との間の ADA 力価に有意差はありませんでした (図 5a)。 対照的に、アテゾリズマブ治療後のヒト化ミニブタのADA力価は有意に低く（P = 0.0075）（図5b）、これら2つの治療用Ab間の免疫原性の違いを反映しています。 ヒト IgG トランスジェニック ミニブタの結果は、ヒトで観察された結果と hIgG1 トランスジェニック マウスでの研究のデータを再現しています 20。

a、セルグツズマブ アムナロイキンによる免疫化後のブタ IgG 抗セルグツズマブ アムナロイキン抗体 (TG ミニブタ、n = 4; WT ミニブタ、n = 4)。 b、アテゾリズマブによる免疫後のブタ IgG 抗アテゾリズマブ抗体。 赤い点線は力価 200 での任意の閾値を示します。二元配置 ANOVA による統計分析。 水平バーは中央値を表します。 各データ ポイントは生物学的複製を表します。

ソースデータ

薬理学的研究の予測可能性を確保するために、ICH は関連する動物モデルの使用を推奨しています。 しかし、治療用抗体を含む組換えタンパク質を用いた長期にわたる毒性学的、薬物動態学的および薬力学的研究は、外来タンパク質に対する動物の免疫応答によって妨げられます。 これらを克服するために、過去数十年にわたり、ほとんどのヒト組換えタンパク質は、特定のヒトタンパク質に耐性のあるトランスジェニックマウスで評価され 21、抗体の場合は IgG 耐性マウスモデルで評価されてきました 8、9、10。 しかし、いくつかの要因により、免疫原性の評価への応用が制限されています。 これらには、遺伝的多様性の欠如と、近交系マウス系統間の免疫機構の基本的な違いが含まれます 22,23。 さらに、マウスのサイズにより、硝子体内投与などの特定の投与経路を介して免疫原性を研究するためのマウスの使用が制限されます。 ブタとヒトの解剖学的構造、生理学、生化学の類似性により、ブタは前臨床安全性試験に適した非げっ歯類モデルとして提案されています。 免疫系のタンパク質を含むほとんどのタンパク質は、ヒトのタンパク質と構造的および機能的類似性を共有しています。 マウスと比較して、ブタの免疫系はヒトの免疫系によく似ており 24、マウス系統ほど近交系ではありません。 いくつかの系統のミニブタ (ハンフォード、ユカタン、ユカタン マイクロ、シンクレア、ゲッティンゲン) が開発されており、前臨床の安全性評価に一般的に使用されています 25。 ゲッティンゲン ミニブタは、明確に定義された遺伝的背景と生理学的パラメーター (血液学および臨床化学パラメーター、血行動態) を備えており、理想的なモデル動物となっています。 ただし、より多くの実験試薬、動物の世話、飼育が必要となるため、ブタはげっ歯類モデルと比較してより高いコストを必要とすることに言及しなければなりません。 それにもかかわらず、ブタの大きさと解剖学的構造/生理学により、より適切な薬物動態研究や、マウスでは達成が難しい硝子体内注射や吸入などの投与経路が可能になります。

我々は、組換えヒト抗体を用いた前臨床研究で使用するための、遺伝子操作されたゲッティンゲン ミニブタ モデルについて説明しました。 ヒト IgG1 および IgG4 遺伝子のミニレパートリーをブタの生殖系列に導入することにより、すべてではないがほとんどのヒト組換え抗体に対して耐性を示すミニブタを作製しました。

我々は、ヒト IGH-γ1-γ4 および IGK 生殖系列遺伝子の再構成と血清ヒト IgG タンパク質の産生に成功したことを示しました。 ヒトスイッチ配列 (Sμ、Ig-Sγ1) をトランスジェニック構築物に組み込むと IgG4 mRNA が発現し、ブタのスイッチ機構による適切なプロセシングが示されました。 トランスジェニックミニブタは、新しい形質を安定して子孫に伝えました。 発現レベルは低かったものの、ヒト IgG タンパク質の量は、ヒト IgG1 Ab に対する免疫寛容を誘導し維持するのに十分でした。

我々は、臨床免疫原性を誘発する（アテゾリズマブ、セルグツズマブ・アムナロイキン）か欠如する（ダラツムマブ、ベバシズマブ）4つの治療用Abを使用することにより、ヒトAbに対する免疫寛容を示しました。 予想通り、アテゾリズマブとセルグツズマブ アムナロイキンは hIgG トランスジェニック ミニブタにおいて ADA を誘導しましたが、ベバシズマブとダラツムマブは誘導しませんでした。 ベバシズマブに対する免疫応答は野生型ミニブタでは強かったが、ダラツムマブによる治療後は低かった。 ダラツムマブは、CD38 発現がん細胞を枯渇させる多発性骨髄腫に対する承認済みの免疫療法です 26。 ダラツムマブのブタ CD38 への結合の残留と、その後の ADA 分泌形質細胞の枯渇を排除することはできず、これが免疫応答の低さを説明する可能性があります。 我々はさまざまな/多数のヒトIgG1抗体に対する耐性を示しましたが、より広範囲のヒト抗体に対する耐性を評価するにはさらなる実験が必要です。

アテゾリズマブおよびセルグツズマブのアムナロイキン抗体に応答して ADA が形成される理由は、それらの作用機序に関連していると考えられています。 セルグツズマブ アムナロイキンのインターロイキン 2 (IL-2) バリアントは、ヒトとブタの両方の IL-2 受容体と交差反応し (配列相同性と実験データに基づいて 27)、免疫と寛容において重要な役割を果たすことが知られています 28 。 アテゾリズマブは、ヒト、マウス、ブタの間で高度に保存されている 16 個の重要なアミノ酸残基 29 を介して、ヒトプログラム死リガンド 1 (PD-L1) と密接に接触します。 ヒト PD-L1 / アテゾリズマブ複合体の結晶構造 29 に基づいて、マウスとブタの PD-L1 / アテゾリズマブ相互作用の構造インシリコ モデルを作成しました。これは、マウスと比較してブタ複合体の結合特性が強いことを示唆しています（補足）図2）。 これらのデータと、アテゾリズマブとマウス PD-L1 の相互作用が実験的に確認されているという事実に基づいて 30、ブタ PD-L1 との同様の交差反応性が推測されます。 したがって、免疫原性のメカニズムは、自己寛容の重要な調節因子である PD1/PD-L1 相互作用の阻害に関連している可能性があります 31。

標的に結合したときの治療用抗体の薬理が毒性の主要な要因であり、免疫原性プロファイルに影響を与えることはよく知られています 32,33。 したがって、交差反応性が欠如すると、hIgG トランスジェニック動物モデルの有用性が制限されることになります。 現在のデータは、ほとんどのヒト抗原とブタ抗原の間で高い配列類似性を示しているため、これは問題を引き起こすはずはありません 34,35,36 が、試験される新しい抗体ごとに考慮される必要があります。

hIgG トランスジェニック ミニブタは、非免疫原性 Ab を許容しながら免疫原性化合物に応答する感度が高いため、治療用抗体の安全性評価および起こり得る副作用の予測に理想的なモデルとなります。

ICH は、前臨床安全性試験を予測動物モデル (齧歯類 1 種と非齧歯類 1 種) で実施するよう求めています。 以前に作製されたマウス系統と新たに派生したヒト化ミニブタは、ヒト組換え抗体に対するこれらの要件を満たしているため、安全性と有効性の試験が可能になり、NHP での研究の必要性が軽減される可能性があります。

トランスジェニック豚の作出と動物実験の実施については、ドイツのオーバーバイエルン州政府から許可が発行されました (ROB-55.2-1-54-2532-6-13)。 実験は、ドイツ福祉法および実験動物の管理と使用に関する欧州連合規範に従って行われました。

可溶型のヒト Ig 重鎖 γ (IGH) および Ig κ 軽鎖 (IGK) をコードする 2 つの組換え DNA 構築物を、以前に記載されているように生成しました 10。 IGH-γ1-γ4 コンストラクト (31.4 kb) は、5 つの可変領域 (VH 1-69、VH 4-59、VH 3-30、VH 3-23、VH 1-18)、5 つの多様性領域を含む 10.9 kb の領域で構成されます。 (DH3-3、DH 4-4、DH2-8、DH3-9、DH3-10)、結合エレメント JH-1 から JH-6、イントロン エンハンサーおよびスイッチ (Sμ) 領域を含む 8.5 kb フラグメント、分泌型 IgG1 および IgG4 アイソフォームをコードする定常 γ-1 (エクソン 1 ～ 4) および γ-4 (エクソン 1 ～ 4) を含む 9.1 kb フラグメント。 すべての領域は、長さ 400 bp ～ 1.3 kb のヒト IGH 遺伝子の内因性配列に隣接していました。 IGK コンストラクト (10.9 kb) は、2 つの可変領域 (Vκ 3-20 および Vκ 1-17) を含む 1.5 kb フラグメント、5 つの結合要素 Jκ-1 ～ Jκ-5 を含む 5.6 kb フラグメント、C 領域、およびマウスで構成されます。 Igκ 3' エンハンサー (E) 要素。 すべての断片は、長さ 500 bp ～ 1.7 kb のヒト IGK 遺伝子の内因性配列に隣接していました。

ブタ腎臓線維芽細胞 (PKF) は、標準的な方法により雄のゲッティンゲン ミニブタから単離されました 37。 PKFは、10％FBS（ウシ胎児血清）、2mM NEAA（非必須アミノ酸）および2mM l-グルタミンを補充した高グルコースDMEMで培養した。 細胞は 3 ～ 5 日ごとに継代され、37 °C、5% CO2 のインキュベーター内で 50 ～ 90% のコンフルエンシーに維持されました。 すべての化学薬品は Sigma-Aldrich から購入しました。

継代した 1 ～ 2 個の PKF を、IGH-γ1-γ4 (31.4 kb) および IGK (10.9 kb) 発現ベクターと、濃度の選択マーカー遺伝子 (PGK 駆動ブラストサイジン、BS; 1.05 kb) でエレクトロポレーションしました (Eporator、エッペンドルフ)。それぞれ13μg、4.5μg、0.05μg（モル比10：10：1）。 3 つの導入遺伝子はすべて、プラスミド骨格を除去することによってトランスフェクション用に準備されました。 IGKおよびIGH-γ1-γ4構築物を分取パルスフィールド電気泳動および電気溶出によって精製し、BS発現カセットをWizardキット(Sigma-Aldrich)を使用したアガロースゲル電気泳動によって精製した。 トランスフェクションでは、細胞に 1,200 V の電気パルスを 85 μs 加えた後、室温で 5 分間インキュベートしました。 トランスフェクションの48時間後、細胞を8μg ml-1 BSで選択した。 個々の安定したトランスフェクト細胞クローンを単離し、各クローンのサンプルを初期段階で凍結保存し、さらなる分析のために複製サンプルを培養しました。

個々の安定なトランスフェクト細胞クローンから単離された DNA を PCR スクリーニングに使用しました。 以下のプライマーを使用して、IGH-γ1-γ4 導入遺伝子の存在を同定しました: IGH_F および IGH_R は 1.4 kb フラグメントを増幅し、IGK ​​導入遺伝子：IGK_F および IGK_R は 1.26 kb フラグメントを増幅しました。 BS 導入遺伝子の場合: BS_F および BS_R プライマーを使用して 0.5 kb フラグメントを増幅しました。 プライマー配列を補足表 2 に示します。PCR は GoTaq ポリメラーゼを使用して実行されました。 熱サイクルパラメータは次のとおりです: 5 分、95 °C。 その後、15 秒、95 °C を 35 サイクル行います。 30秒、60℃。 1 分、72 °C。 続いて 72 °C で 5 分間。

核移植は前述のように実施されました 38。 簡単に説明すると、インビトロで成熟した卵母細胞を除核し、単一のドナー細胞を各卵母細胞の卵周囲腔に配置しました。 融合および胚の活性化の後、再構成された胚が、ホルモン周期に同期したレシピエント雌ブタの卵管に移されました。 80〜120個の再構成胚が各レシピエントの未経産雌豚に移植されました。

ddPCR は前述のように実行されました 39。 導入遺伝子のコピー数は、蛍光標識プローブ: IGH 5'FAM-ATGGGCACGACCGACCTGAGC-BHQ3' (プライマー: dIGH_F および dhIGH_R) を使用して決定されました。 IGK 5'FAM-AGGGCTTCACAGATAGAGCTCATTTT-BHQ3' (プライマー: dIGK_F および dIGK_R)。 GAPDH プローブ 5'HEX-TGTGATCAAGTCTGGTGCCC-BHQ3' (dGAPDH_F および ddGAPDH_R) をリファレンスとして使用しました。 プライマー配列を補足表 2に示し​​ます。標的遺伝子は、QX100 システム (BioRad Laboratories) を使用して定量しました。

1 歳 (F3) 雄のヒト IgG トランスジェニック ミニブタの血液を K2EDTA チューブに採取し、続いて RNAlater と混合し、-80 °C で保存しました。 RiboPure 血液 RNA 精製キット (Invitrogen) を使用して、血液から RNA を抽出しました。 Agilent 2100 Bioanalyzer で測定したところ、RNA 完全性数 (RIN) は >9 でした。 RNA は、入力として 500 ng の全 RNA を含む SuperScript IV VILO Master Mix (Invitrogen) を使用して転写されました。 続いて、組み換えられたヒト IgG 転写物を、Q5 High-Fidelity PCR キット (NEB) を使用した PCR によって増幅しました。 まず、異なる可変重鎖および可変カッパ軽鎖セグメントに特異的な７つのフォワードプライマーを、共通の定常重鎖および定常カッパ軽鎖配列に結合するリバースプライマーと組み合わせて使用​​した。 次に、QIAquick PCR精製キット(Qiagen)を用いてPCR産物を精製した。 重鎖反応からの PCR 産物は、別のセットの 5 つのプライマーペアを使用したネステッド PCR のテンプレートとして使用されました。 すべてのプライマー配列を補足表 2 に示します。続いて、TruSeq Nano DNA サンプル調製プロトコル (Illumina) を使用して、10 pM の各精製 PCR 産物から Illumina 配列決定ライブラリを調製しました。 サンプルライブラリーは、ペアエンドシーケンスを使用して 2 × 300 サイクルの Illumina MiSeq 実行でシーケンスされました。

usearch ツール バージョン 0.667_i86linux32 とパラメーター -fastq_pctid 75 および -fastq_maxdiffs 2540 を使用して、重複するペアエンド リードの両方のメイトをマージしました。その後、リードは予想されるフレーム内のアミノ酸配列に翻訳され、予想される 5 つの隣接するアミノ酸の存在についてフィルターされました。潜在的に機能的な再配置を得るには、酸と停止コドンの欠如が必要です。 補足の図1aは、取得された読み取り数を示しています。

MyOne Streptavidin T1 Dynabeads (Invitrogen) を洗浄し、標準に従ってサンプルあたり 4 μg のビオチン化マウス抗ヒト IgG1 (クローン HP6069、Invitrogen) または 5 μg のビオチン化マウス抗ヒト Ig κ (クローン G20-193、BD) でコーティングしました。プロトコル。 免疫沈降のために、コーティングされたビーズを、PBSで1:2に希釈したミニブタ血清100μlとともにローテーター上で4℃で一晩インキュベートしました。 その後の洗浄ステップの後、沈殿したヒト IgG1 またはヒト Ig κ 抗体を 2x Laemmli サンプルバッファー (BioRad) を使用して 95 °C で 10 分間加熱して溶出し、mini-PROTEAN TGX ゲル (4 ～ 20%、BioRad) に直接ロードしました。 。 100 ngのヒトIgG1κ抗体をスパイクした野生型ミニブタ血清を陽性対照とし、SeeBlue Plus2 (Invitrogen)とMagicMark XP (Invitrogen)を分子量マーカーとして使用しました。 電気泳動による分離後、サンプルをニトロセルロース膜 (iBlot、Invitrogen) に移しました。 トリス緩衝生理食塩水 - Tween (TBST) 中の 5% 脱脂粉乳でブロッキングした後、膜を 1:5,000 西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) ヤギ抗ヒト IgG H+L (ポリクローナル、ジャクソン) または 1:10,000 HRP マウスでプローブしました。抗ヒト Ig κ (クローン EPR5367-8、Abcam) を使用し、SuperSignal West Femto 基質 (Thermo Fisher) を使用して開発されました。41,42

ヒト IgG の定量のために、Nunc MaxiSorp ELISA プレート (Invitrogen) を、コーティング緩衝液 (0.1 M 重炭酸ナトリウム pH 9.6、Alfa) 中の 1 μg ml-1 のウサギ抗ヒト IgG H+L (ポリクローナル、OriGene) でコーティングしました。一晩で4℃。 プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、２％ ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含むＰＢＳで１時間ブロッキングした。 ミニブタ血清サンプルまたは陽性対照としての精製ヒト IgG1k の段階希釈物を PBS + 1% FBS で調製し、洗浄した ELISA プレート上で室温で 2.5 時間インキュベートしました。 その後の洗浄後、HRP 抗ヒト IgG (クローン G18-145、BD) を使用して結合ヒト IgG を室温で 1 時間プローブし、洗浄し、Ultra TMB-ELISA 基質 (Thermo Fisher) を使用して展開しました。 ５分後に０．１８Ｍ硫酸（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して反応を停止し、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。 4 つの標準曲線の OD 値を補間して、血清中のヒト IgG1 の濃度を計算しました。

完全なヒトまたはハイブリッドのブタ/ヒト IgG タンパク質の存在を検出するために、以下の抗体を用いて上記のように ELISA を実行しました: (1) ヤギ F(ab')2 抗ヒトκ 軽鎖 (LC) 特異的 Ab でコーティング (ポリクローナル、Sigma-Aldrich）およびHRP標識抗ヒトIgG重鎖（HC）Ab（クローンG18-145、BD）による検出（ヒトIgGの認識用）。 (2) マウス抗ヒト Ig κ LC 特異的 Ab (クローン G20-361、BD) でコーティングし、HRP 標識マウス抗ブタ IgG HC (クローン 1G5H7、ProSci) で検出 (ブタ/ヒト IgG の認識用) ）。

雌雄のヒト IgG トランスジェニック ミニブタと WT ゲッティンゲン ミニブタを、PBS で希釈した抗原を 1 週間に 2 回、7 回の皮下注射で並べて免疫しました。 抗原は以下の用量で投与した：KLH 20 mg kg-1; KLH 20 mg kg-1。 ベバシズマブ、ダラツムマブ、セルグツズマブ アムナロイキン、およびアテゾリズマブ 0.4 mg kg-1 体重。

血液サンプルは 0 日目 (未処置) に採取され、注射前の 4 ～ 5 週間にわたって毎週間隔で採取されました。 血液を血清 Z-Gel チューブ (Sarstedt) に収集し、室温で 30 分間凝固させた後、遠心分離しました。

ADAの検出のために、ELISAプレートを、上記のように免疫化に使用した抗原またはその断片5μg ml-1でコーティングした。 連続希釈した血清サンプル (1:50、次に 1:3 で計 8 回希釈) を室温で 2 時間インキュベートし、アルカリホスファターゼ結合 AffiniPure ヤギ抗ブタ IgG ( H+L) (ポリクローナル、ジャクソン) 検出抗体。 続いて、ELISA プレートを p-ニトロフェニル リン酸 (Merck Millipore) で 10 分間発色させた後、405 nm での OD を読み取りました。

ADA IgG 力価の計算では、すべてのナイーブ サンプルの 1:50 希釈での平均 OD に標準偏差の 6 倍を乗じて、各研究のカットオフ値を決定しました。 ベースライン外れ値は、四分位 3 の四分位範囲の 1.5 倍を超えると判断され、除外されました。 滴定された血清サンプルの OD 値は 5 次多項式を使用してフィッティングされ、力価はこの曲線と決定された閾値との交点によって決定されました。 任意の閾値 200 を超える力価はすべて陽性と判定されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究の結果を裏付けるデータは、論文およびその補足情報から入手できます。 図のソース データはこのペーパーに付属しています。 研究中に生成された生のデータセットと分析されたデータセットは、リクエストに応じて対応する著者から入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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リファレンスをダウンロードする

実験的支援については L. Petersen および R. Moser、力価計算については G. Steiner、抗体交差反応性に関する有益な情報については C. Klein および S. Klostermann に感謝します。 さらに、VDJ シーケンスの開始については PJ Knuckles、A. Kiialainen、U. Nelböck-Hochstetter に、継続的な獣医師と組織の支援については A. Greiter-Wilke と EM Amen に感謝します。 この研究は F. Hoffmann-La Roche Ltd から資金提供を受けました。

次の著者も同様に貢献しました: Tatiana Flisikowska、Jerome Egli、Angelika Schnieke、Antonio Iglesias。

ドイツ、フライジング、ミュンヘン工科大学生命科学部ヴァイエンシュテファン分子生命科学科、家畜バイオテクノロジー学部長

タチアナ・フリシコフスカ, クシシュトフ・フリシコフスキ, マレーネ・シュトゥンバウム & アンジェリカ・シュニーケ

ロシュ製薬研究および初期開発、ロシュ・イノベーション・センター・バーゼル、バーゼル、スイス

ジェローム・エグリ、エリック・キュン、マーティン・エベリング、ローランド・シュムッキ、トーマス・シンガー、フェリックス・ウェーバー、アントニオ・イグレシアス

ロシュ製薬研究および初期開発、ロシュ イノベーション センター ミュンヘン、ペンツベルク、ドイツ

ギィ・ジョルジュ

ルートヴィヒ・マクシミリアン大学ミュンヘン、ミュンヘン、ドイツ、遺伝子センターおよび獣医学部、分子動物育種およびバイオテクノロジー

黒目真由子、バーバラ・ケスラー、ヴァレリ・ザハルチェンコ、エックハルト・ウルフ

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AI、TS、AS、TF は研究の構想と設計に貢献しました。 JE、TF、AI、AS が論文を執筆しました。 TF、KF、MS、MK、BK、VZ、EW、JE、EK が実験を実施しました。 JE、TF、AS、AI、FW、ME、RS、GG がデータを分析および解釈しました。 すべての著者が原稿に対して積極的で貴重なフィードバックを提供してくれました。

フェリックス・ウェーバーまたはアンジェリカ・シュニーケとの通信。

JE、EK、ME、RS、GG、TS、FW および AI は、F. Hoffmann-La Roche Ltd の従業員です。他の著者は競合する利害関係を宣言していません。

Nature Biomedical Engineering は、この研究の査読に貢献してくれた John Hammond、Bernd Jilma およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

二重抗体サンドイッチ ELISA を、F0 (n = 4)、F1 (n = 4)、および F2 (n = 4) のトランスジェニック ミニブタから単離した血清を用いて実行しました。 ヒト (Sigma-Aldrich) (1:100 希釈) および野生型 (WT、n = 10) 血清を対照サンプルとして使用しました。 a、トランスジェニックミニブタから単離された血清中の完全ヒトIgG1タンパク質（コーティング：ヤギ抗ヒトκ軽鎖（LC）特異的Ab、検出：HRP標識抗ヒトIgG重鎖（HC）Ab）の存在 b、ELISAハイブリッドブタ/ヒト IgG を検出する (コーティング: マウス抗ヒト Ig κ LC 特異的 Ab、検出: マウス抗ブタ IgG HC) とブタ LC との交差反応性が示され、WT および TG ミニブタで陽性シグナルが得られました。 しかし、マウス抗ブタ IgG HC による検出では、完全ヒト IgG タンパク質の発現を示すトランスジェニック ミニブタのシグナルは有意に増加しませんでした。 統計分析は、通常の一元配置分散分析 (ANOVA) および Holm-Sidak の多重比較検定によって実行されました。 p = P 値、ns = 有意ではない、エラーバーは標準偏差を表します。 各データ ポイントは生物学的複製を表します。

ソースデータ

補足の図と表。

図 2a の切り取られていないウェスタンブロット。

図のソースデータ。 2a および 3 ～ 5、および拡張データの場合 図 1。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Flisikowska、T.、Egli、J.、Flisikowski、K. 他。 治療用組換え抗体の毒性試験用のヒト化ミニブタ モデル。 ナット。 バイオメッド。 Eng 6、1248–1256 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41551-022-00921-2

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受信日: 2021 年 7 月 15 日

受理日: 2022 年 7 月 1 日

公開日: 2022 年 9 月 22 日

発行日：2022年11月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00921-2

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